[发明专利]一种核酸测序方法

权利要求书

1.一种核酸测序方法，所述的测序方法包括如下步骤：

（1）提供聚合酶，所述的聚合酶通过可断裂基团与dNTP连接，并且所述的聚合酶可发出光信号；

（2）使所述聚合酶与待测核酸模板-引物复合体的引物3'端接触，所述聚合酶上的dNTP与待测核酸的序列上的碱基互补配对并在聚合酶酶促反应加入引物3'端；

（3）检测所述聚合酶发出的光信号；

所述聚合酶为Bst DNA Pol的变体，所述的Bst DNA Pol的变体的氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。

2.根据权利要求1所述的一种核酸测序方法，其特征在于，所述的可断裂基团含有可断裂结构X，所述的X选自：

其中，j为1-3的整数，

R选自H、C₁-₁₀直链或支链烷基、C₂-₁₀烯基、C₂-₁₀炔基、C_3-10环烷基、芳基、含有N、O或S的杂环芳基、含有N、O或S的杂环烷基、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-CON(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)CO(C_0-10烷基)、COR₁、CN，C₁-₁₀烷氧基，芳氧基，含有N、O或S杂芳氧基，上述基团中的H可被以下基团取代：卤素、-CN、-OCH₂F、-OCHF₂、-OCF₃、-OH、C_1-10直链或支链烷基、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-OC_0-10烷基、C_3-10环烷基、-O杂环烷基、-N杂环烷基、-S杂环烷基、-N杂环芳香基、-O杂环芳香基、-S杂环芳香基，R₁选自H、OC_0-10烷基、C₁-₁₀直链或支链烷基，

R'选自N或O。

3.根据权利要求2所述的一种核酸测序方法，其特征在于，所述的可断裂基团具有L1-L2-X-L3-L4结构，其中，L1为与dNTP或修饰的dNTP结合的端基，L2和L3不存在或为不可断裂连接基团，L4为与聚合酶结合的端基。

4.根据权利要求3所述的一种核酸测序方法，其特征在于，所述的L1或L4独立的选自马来酰亚胺基、羧基、巯基、叠氮基、炔基、环辛炔基及其衍生物、四嗪基、二硫吡啶基、乙烯基、烯砜基、琥珀酰亚胺基、醛基、酰肼基、胺氧基和α-卤代羰基。

5.根据权利要求3所述的一种核酸测序方法，其特征在于，所述的L2或L3独立的选自-O(CH₂CH₂O)_i-、-(CH₂)_i-、-(CH₂)_iNH(CH₂)_i-、-(CH₂)_iCOO(CH₂)_i-、-(CH₂)_iCONH(CH₂)_i-、-(CH₂)_iO(CH₂)_i-、-(CH₂)_iCO(CH₂)_i-或中的一个或二个以上基团的组合，所述的i选自0-10的整数。

6.根据权利要求1所述的一种核酸测序方法，其特征在于，所述聚合酶连接有一个或多个荧光标记物、磷光标记物或者化学发光标记物。