[发明专利]两元微生物复合菌剂及制备方法

权利要求书

1.一种两元微生物复合菌剂，其特征在于，包括有效活菌数含量≥5×10⁸ cfu/mL的液体复合发酵菌，所述液体复合发酵菌包括液体兼氧芽孢杆菌和液体高温固氮菌，且所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的适应温度均包括30℃～55℃。

2.根据权利要求1所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述液体兼氧芽孢杆菌中的兼氧芽孢杆菌菌株来源于淤泥，其筛选方法包括：（1）将淤泥自然风干并加入无菌水中静置；（2）进行75℃～90℃水浴处理，并冷却获得淤泥混合物；（3）所述淤泥混合物进行摇床培养处理，形成兼氧芽孢杆菌原菌液；（4）采用梯度稀释法对所述兼氧芽孢杆菌原菌液进行肉汤平板培养，在第一平板上获得兼氧芽孢杆菌一代菌落；5）挑取所述第一平板中所述兼氧芽孢杆菌一代菌落比较大的菌种进行液体三角瓶培养，并从浑浊度较强的三角瓶中选取兼氧芽孢杆菌单菌株；6）对所述兼氧芽孢杆菌单菌株进行温度适宜范围验证试验，从中选取温度适应范围为30℃～55℃的菌株为最终的目标兼氧芽孢杆菌菌株。

3.根据权利要求1所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述液体高温固氮菌中的高温固氮菌菌株来源于花生地的土壤，其筛选方法包括：（1）将花生地的土壤自然风干并加入无菌水中静置，然后进行摇床处理，并二次静置获得上清菌液；（2）对所述上清菌液接入无氮液体培养基中，先在45℃～50℃进行培养，再降温至42℃～38℃进行培养，获得高温固氮菌原菌液；（3）采用梯度稀释法对所述高温固氮菌原菌液进行无氮培养基固体平板培养，在第二平板上获得高温固氮菌一代菌落；（4）挑取所述第二平板中所述高温固氮菌一代菌落比较大的菌种进行无氮斜面培养基培养，得到高温固氮菌单菌株；（5）对所述高温固氮菌单菌株进行温度适宜范围验证试验，从中选取温度适应范围为30℃～55℃的菌株为最终的目标高温固氮菌菌株。

4.根据权利要求1～3任一项所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的体积比为7:3～ 9:1，且所述液体兼氧芽孢杆菌的浓度为5.5×10⁸ cfu/mL～1.0×10⁹ cfu/mL，所述液体高温固氮菌的浓度为0.5×10⁸ cfu/mL～1.0×10⁸ cfu/mL。

5.根据权利要求4所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述两元微生物复合菌剂还包括菌株活性保护剂，该菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:19 ～ 9:41。

6.根据权利要求5所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述菌株活性保护剂包括质量百分比浓度为80%～100%的糖蜜和质量百分比浓度为40%～60%的氨基酸，其中，所述糖蜜与氨基酸的质量比为13:7 ～ 9:1。

7.根据权利要求6所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:9 ～ 3:17。

8.一种根据权利要求1～7任一项所述的两元微生物复合菌剂的制备方法，包括步骤：

液体兼氧芽孢杆菌的制备 采用枯草芽孢杆菌扩培培养用的培养基于45℃～55℃扩培培养兼氧芽孢杆菌，获得液体兼氧芽孢杆菌；

液体高温固氮菌的制备 将高温固氮菌菌株接种至无氮培养基中，在38℃～44℃进行扩培培养，获得液体兼氧芽孢杆菌；

复合发酵菌剂的制备 将所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体兼氧芽孢杆菌均匀混合，制备所述两元微生物复合菌剂。

9.根据权利要求8所述的两元微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述复合发酵菌剂的制备步骤还包括将菌株活性保护剂、所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体兼氧芽孢杆菌均匀混合的步骤，其中，所述菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:19 ～9:41。

10.根据权利要求8或9所述的两元微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌株活性保护剂的制备方法包括将质量百分比浓度为80%～100%的糖蜜和质量百分比浓度为40%～60%的氨基酸按照质量比13:7 ～ 9:1均匀混合的步骤。