[发明专利]一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用

说明书

本发明公开一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用。本发明基于柑橘黄龙病亚洲种保守序列16S rDNA开发的RPA扩增引物HLBas‑F/HLBas‑R，首次建立了一种用于检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测方法，有效排除假阳性的干扰，检测耗时较短，经济适用，无需PCR仪、荧光定量PCR仪等昂贵仪器设备，简单易学；可为我国柑橘无病种苗的黄龙病早期检测、田间疑似黄龙病树的检测确诊、普及基层科研单位的检测能力提供有力的技术支持，从而推动我国柑橘无病种苗繁育的健康发展、提早预警广大柑橘产区柑橘黄龙病的传播扩散，进而促进我国柑橘产业的可持续发展。

技术领域

本发明涉及一种我国植物检疫性病害的检测技术，特别涉及一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用。

背景技术

柑橘黄龙病(Huanglongbing)是一种世界性的毁灭性病害，具有暴发性强，发展迅猛，危害大等特点，被列为我国对内对外的检疫性病害。柑橘黄龙病正在全球柑橘种植区不断扩散蔓延，如亚洲、非洲、美洲等地区。柑橘黄龙病发生流行持续时间长、发病范围广、发病率高，造成我国部分地区柑橘寿命短、产量低、生产成本高，经济损失惨重，严重制约了我国柑橘产业的健康发展。2017年我国南方柑橘生产10省(区)柑橘黄龙病发生面积16万公顷，广东省柑橘面积因黄龙病从25万公顷缩减到22万公顷，江西赣南地区的脐橙从近10万公顷剧减至5万公顷。

目前，柑橘黄龙病普遍认为是由局限于韧皮部的候选韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacter spp)侵染引起，但至今未获得一致认可的纯培养。根据病原的热敏性、传播媒介、保守序列特征等可以将其分为3个种，包括：亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus)、非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲种(CandidatusLiberibacter americanus)。国内学者对柑橘黄龙病原的16S rDNA同源性分析表明，侵染我国柑橘的黄龙病菌均为亚洲种，序列测定与多重比对结果也表明在不同的地域病原菌没有发现较大的分子变异。

柑橘带病苗木、带菌接穗和田间病株是黄龙病的初侵染源。农业生产中，防控柑橘黄龙病等毁灭性病害最根本的措施之一是培育、种植无病苗木，供新区和无病区的新果园种植。自20世纪70年代柑橘茎尖嫁接脱毒研究成功后，美国、西班牙、巴西、中国等国已相继建立了各自的柑橘无病毒繁育体系。目前国内外已建立和发展了常规PCR、巢式PCR、半巢式PCR、荧光定量PCR等技术来检测柑橘黄龙病菌，不断地提高了检测的灵敏度和准确率。目前的PCR检测主要针对扩增柑橘黄龙病菌16S rDNA、23S rDNA、16S-23S rRNA ITS、OMP基因、β-operon基因、RNR基因等。

目前已建立的常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等柑橘黄龙病病原检测技术，虽然不断地提高了检测的灵敏度和准确率，但是检测时间依然比较费时，荧光定量PCR由于昂贵的试验设备和试剂耗材，检测费用依然居高不下。目前测算常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR检测黄龙病菌单个样品的价格在100～200元之间，检测时间在3～5小时之间。常规PCR虽然检测费用较低，但检测灵敏度较低，适合田间已发病植株的检测确认。巢式PCR检测灵敏度是普通PCR的100倍，由于需要两次PCR，操作比较繁琐费时。荧光定量PCR检测灵敏度是巢式PCR的10倍，由于其高灵敏度，推动了柑橘黄龙病的早期诊断及预防控制，尤其是种苗的检测，但是荧光定量PCR的假阳性问题比较突出，操作精度要求比较高，市县级基层科研单位难以推广应用。目前开发一种高效、精准、低成本、操作简便的黄龙病病原检测技术，依然是我国基层科研单位、广大柑橘种植企业、柑橘育苗企业的迫切需求。