[发明专利]一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、引物、检测方法及应用

说明书

本发明提供一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、引物对、检测方法及应用。该方法本地数据库的初筛结果和在线比对的复筛结果发掘副溶血性弧菌中的可用于检测的特异性基因序列，利用发掘出的特异性靶基因结合传统靶基因构建双重实时荧光PCR方法，PCR引物对分别根据自筛靶基因VPA1585以及传统靶基因tlh设计而成，为保证检测方法的高特异性及灵敏度，采用双重实时荧光PCR方法，合理优化PCR反应体系，并创新创新性地使用第三代饱和荧光染料SYTO Green 9替换了传统实时荧光PCR体系中的非饱和荧光染料SYBR Green，可以快速、准确地鉴定出副溶血性弧菌。

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、基于特异性靶点VPA1585和传统靶点tlh的引物及应用、和利用VPA1585与tlh相结合，构建双重实时荧光PCR体系，对副溶血性弧菌进行检测的方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种人类病原体，广泛分布在海洋环境中，经常从各种生海鲜中分离出来，食用被副溶血性弧菌污染的为加工或未煮熟的海鲜产品可能会导致食物中毒，并导致急性肠胃炎的发展，尽管由副溶血性弧菌引发的肠胃炎通常是自限性的，但对于患有基础疾病如肝病或免疫疾病的人来说，可能危及生命。

目前针对副溶血性弧菌较为普遍且易行的检测方法为基于PCR的分子生物学方法，如实时荧光PCR、多重PCR、环介导等温扩增等，此类方法的精准度和特异性主要依赖于检测靶点的选择。目前常用的副溶血性弧菌检测靶点如tdh、trh、tlh、groEL及toxR基因，但上述基因在实际应用的检测过程中被发现具有一定的局限性或误检率，使得检测效率及准确度降低，且不能将PCR方法的优势完全发挥。挖掘副溶血性弧菌快速检测靶点基因可以提高检测效率、准确性以及可靠性，具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供如下1)-8)中任一种物质作为特异性靶点在非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌中的应用：1)VP0091；2)VP0289；3)VP04884)；4)VP0811；5)VP1742；6)VPA0249；7)VPA1407；VPA1585。

本发明的第二个目的是提供检测如下1)-8)中任一种物质的制品在制备副溶血性弧菌检测试剂中的应用，其特征在于，1)VP0091；2)VP0289；3)VP04884)；4)VP0811；5)VP1742；6)VPA0249；7)VPA1407；8)VPA1585。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测副溶血性弧菌的双重实时荧光PCR引物。

本发明的第四个目的是提供一种检测副溶血性弧菌试剂盒，所述试剂盒中包括引物VPA1585-F、VPA-1585-R以及tlh-F及tlh-R。

本发明的第五个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌的方法，包括以下步骤：(1)副溶血性弧菌特异性靶点挖掘；(2)双重实时荧光PCR体系建立；(3)双重实时荧光PCR方法特异性及灵敏度评估。通过本地数据库的构建及基因组比较分析等生物信息学方法获得副溶血性弧菌的特异性检测靶点，将特异性靶点与传统靶基因相结合以提高检测精准度和特异性，并创新性的将传统荧光PCR检测中使用的非饱和荧光染料SYBRGreen替换为饱和荧光染料SYTO Green 9，以提高方法的灵敏度和熔解曲线分辨率，较之普通PCR方法，可实现闭管检测，减少样品污染，并省去了电泳检测等繁琐操作；较之TaqMan探针法，无需合成荧光基团修饰探针，较为经济实惠；较之基于细胞培养的传统生物学方法，解决了检测结果不准确，检测过程复杂，检测周期长的问题，实现了副溶血性弧菌高特异性快速检测的目的。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：