[发明专利]Hsp16-3过表达的结核分枝杆菌H37Ra菌株的构建及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16‑3（以下简称Hsp16‑3）过表达的结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌（以下简称H37Ra菌）菌株的构建及其应用。首次利用电穿孔技术，将构建的大肠杆菌‑结核杆菌重组穿梭质粒载体pMV361‑Hsp16‑3，转入H37Ra菌，筛选并鉴定，确定成功构建的菌株，为Hsp16‑3基因过表达的H37Ra菌株。本发明构建的Hsp16‑3过表达的H37Ra菌，增强了Hsp16‑3基因的表达，将提升H37Ra菌对机体的免疫反应，为探索研究Hsp16‑3对H37Ra菌的致病性、免疫保护作用等方面的调控作用，以及新型结核病疫苗研发奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程研究领域，以及结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16-3（以下简称Hsp16-3）过表达的结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株（以下简称H37Ra菌）的构建及其应用。

背景技术

结核病是世界上严重威胁人类健康的传染性疾病。世界卫生组织(WHO)所发布的2019年全球结核病报告中显示，2018年，全球范围内据估约有1000万结核病新发病例，89%的患者为成年患者（≥15岁）。据估计，2018年HIV阴性患者因结核病死亡约120万例，HIV阳性患者因结核病死亡约25.1万例。卡介苗（BCG）是目前世界范围内唯一广泛使用的抗结核疫苗。虽然卡介苗控制儿童结核病十分有效，但对成人结核病的预防效果在不同地区表现出极大差异（0-80%）。随着耐药和耐多药结核病的出现与流行，迫切需要研发安全高效的结核病疫苗。

全球约有1/3人口被结核杆菌潜伏感染，该人群在免疫力下降，尤其是免疫系统受到损害时，则会发展成为结核病，潜伏性感染者已成为结核病患者的一个重要来源。潜伏性结核感染以皮肤结核菌素试验阳性，及(或) γ干扰素释放试验阳性，而无活动性结核的临床表现为特点。结核杆菌Hsp16-3与结核杆菌潜伏感染之间密切相关。结核杆菌在低氧或缺氧状态时会大量合成Hsp16-3，当结核杆菌感染小鼠巨噬细胞后期，Hsp16-3的表达量明显增多，T细胞可以特异性的识别Hsp16-3，并将其从被感染的巨噬细胞中分离出来，这种反应在结核杆菌潜伏期则更为明显，这说明Hsp16-3在结核杆菌潜伏性感染阶段扮演着重要的角色。

Hsp16-3对研发新型结核病疫苗有重要的科学价值。Hsp16-3能够诱导特异性免疫反应，具有鼠和人的T淋巴细胞表位，是有效的亚单位疫苗的靶抗原。宿主对结核杆菌等细胞内寄生菌的防御主要依赖于有效的细胞免疫，其机制为被感染的巨噬细胞被细胞免疫因子所激活，尤其是由自然杀伤细胞和抗原特异性T细胞产生的γ干扰素。Hsp16-3抗原能够部分活化结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验阳性机体的外周血单核细胞和CD4+T淋巴细胞，诱导Thl型细胞免疫反应，并分泌干扰素，有效清除结核杆菌；同时CD8+T淋巴细胞可以识别Hsp16-3的多肽表位，活化的CD8+T淋巴细胞可以诱导产生γ干扰素和α干扰素，从而通过粒细胞溶解素和表位穿孔素溶解被结核杆菌感染的巨噬细胞，因此，对Hsp16-3的研究可以为安全高效的新型结核病疫苗研究提供理论依据，尤其是对潜伏感染者可能起到有效预防作用。

基于此，我们提出构建Hsp16-3过表达的H37Ra菌株，具有以下的优势：

第一，Hsp16-3过表达的H37Ra菌株，可增强其免疫原性，可产生更好的免疫应答，提高对机体的免疫保护作用，有可能单独作为结核病疫苗使用；

第二，为探索结核杆菌的致病机制及控制结核病的传播提供依据，同时为寻找抗结核药物靶标提供新的方向。

发明内容

发明的目的在于提供Hsp16-3过表达的H37Ra菌株的构建方法，并在Hsp16-3基因功能研究的基础上，探讨对结核病的有效防治。

本发明目的，一是构建Hsp16-3过表达的H37Ra菌株，用于结核病预防和新型结核病疫苗研发。