[发明专利]一种能快速检测多种分枝杆菌的方法

权利要求书

1.一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得患者体液样本，并对体液样本进行处理；

(2)提取体液样本核酸；

(3)制备试剂：

Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；

将胞内分枝杆菌引物、引物标记、缓冲液和dNTPs混合；

将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六；

(4)在多个反应管内分别内加入混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六，再在多个反应管内加入体液样本核酸，离心；

(5)将多个反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；

(6)检测步骤(5)中得到的扩增产物，得到检测结果。

2.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(6)中的检测方法包括色度法，包括如下步骤，

A：将阳性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；

将阴性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；

B：对步骤A得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液七和混合液八；

C：在2个反应管内分别加入混合液七和混合液八，再向阳性混合液七的反应管内加入体液样本核酸，向阴性混合液八对应的反应管中加入无核酶PCR级纯水，离心；

D：将阳性混合液七和阴性混合液八的反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；

E：将含有混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六的反应管与含有混合液七和混合液八的反应管在光照下对比；

则步骤(3)中试剂制备时也需要加入荧光剂。

3.如权利要求2所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(3)中加入荧光剂的制备方法为：

Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；

将胞内分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；

Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六。

4.如权利要求2或3所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：所述荧光剂包括Calcein/钙黄绿素、SYBR Green、Eva Green、HNB。

5.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(6)中的检测方法包括试纸检测方法，

体液样本核酸扩增结束后，室温放置，离心，加入TE(Tris-EDTA)缓冲液，混匀，用一次性核酸试纸检测。

6.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤1中所述患者体液样本包括痰样本和其他体液样本；

所述痰样本的处理方法为：使用N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH)进行消化灭活15min；

所述其他体液样本的处理方法为：离心富集细菌。

7.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的缓冲液包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO₄、KCl、Tris、甜菜碱、Tween、(NH₄)₂SO₄。

8.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：所述结核分支杆菌复合群引物、胞内分枝杆菌引物、鸟分枝杆菌引物、脓肿分枝杆菌引物、堪萨斯分枝杆菌引物和偶发分枝杆菌引物的标记包括FITC(异硫氰酸荧光素)、FAM(6-羧基荧光素)、Biotin(生物素)。