[发明专利]以植物甾醇为原料制备胆固醇及其衍生物的方法

权利要求书

1.一种胆固醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以植物甾醇为起始原料，对植物甾醇的3位羟基进行醚化保护，经生物发酵、氧化、GM-2氧化、witting反应、氢化、水解得到胆固醇及其衍生物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胆固醇及其衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)以植物甾醇为起始原料，对植物甾醇的3位羟基进行醚化保护，得到GM-1；

(2)所述GM-1经生物发酵，得到GM-2；

(3)所述GM-2与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)发生氧化反应，得到GM-3；

(4)所述GM-3与异戊基三苯基溴化膦通过witting反应合成GM-4；

(5)所述GM-4经氢化、水解，得到胆固醇及其衍生物。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述植物甾醇具有如式1所示的结构：

即，所示植物甾醇选自菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇。

4.根据权利要求2-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醚化保护的过程包括：将植物甾醇与二甲氧基甲烷混合，然后加入硅藻土、五氧化二磷，搅拌反应，待反应完全后升温，趁热过滤，洗涤，烘干，得到植物甾醇醚化物粗品；采用丙酮对所述植物甾醇醚化物粗品进行纯化，得到所述植物甾醇醚化物GM-1。

5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物发酵的过程包括：(a)种子培养；(b)将步骤(a)培养得到的种子GM-1接种在含有GM-1的培养基中，进行发酵转化，经后处理，回收提取，得到GM-2。

6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述种子培养包括一级种子培养和二级种子培养；

所述一级种子培养包括如下步骤：在冷却且灭菌的培养基的斜面上接种Mycobacterium sp.NRRL B-3805菌种进行培养，得到一级种子；所述培养基含有酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸钠0.54％、磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5；

其中，所述二级种子培养包括如下步骤：在冷却且灭菌的培养基的斜面上接种一级种子进行培养，得到二级种子；所述培养基含有酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸钠0.54％、磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5。

7.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，在发酵罐内装入含有GM-1的培养基，灭菌，冷却，接种二级种子，进行发酵转化，转化结束后调节pH值至5-6，加热搅拌，静置，分层，得到油层；将转化得到的油层用甲醇提取，减压浓缩干溶剂，再加入乙酸乙酯回流打浆，冷却，过滤，滤液回收提取，得到GM-2；

其中，含有GM-1的培养基含有GM-1 2％、大豆油16％、玉米浆6％、硝酸钠5.4％、磷酸氢二铵0.06％，培养基的pH＝8.0。

8.根据权利要求2-任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述GM-2与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)的质量比为(90-110):1；

所述氧化反应包括如下步骤：将GM-1和TEMPO在室温下溶解于二氯甲烷中，降温至0-5℃，加入溴化钠溶液，搅拌，保持温度0-5℃，而后滴加次氯酸钠溶液，滴加过程控温0-5℃，滴加完后保持0-5℃反应，TLC监测，原料反应完后，搅拌下滴加硫代硫酸钠溶液；滴加完后搅拌，静置分液，得到的有机层减压浓缩，甲醇置换浓缩至稠状，降温析晶，过滤，滤饼少量甲醇淋洗，干燥得GM-3。

9.根据权利要求2-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，室温下将异戊基三苯基溴化膦和甲苯搅拌混合，氮气置换，加入叔丁醇钾，升温后反应；而后降温，氮气保护下加入GM-3，保温反应；反应完成后向反应瓶中加入水，分液，有机相水洗；减压浓缩，甲醇置换至稠状，降温析晶，过滤，干燥滤饼，得到GM-4。

10.根据权利要求2-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，在钯碳存在条件下，将GM-4加入甲醇中，先用氮气置换，再用氢气置换，在氢气气氛下升温反应，反应完毕后，降至室温，排掉氢气，过滤，少量甲醇冲洗滤饼，合并母液；向母液中加入稀盐酸，加热进行水解反应，反应完成后调节pH至中性，减压浓缩，水析出料，过滤得到胆固醇。