[发明专利]一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法

说明书

一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE‑pro库的方法，它涉及基因工程领域，本发明的目的是为了提高GUIDE‑seq检测CRISPR脱靶效应的敏感性和特异性，本发明基于链霉亲和素‑生物素系统，开发出GUIDE‑pro，并提供一种准确的可批量进行体内脱靶检测及sgRNA筛选的方法，即一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE‑pro库的方法。本发明的方法敏感性高，脱靶检测更全面；特异性高，假阳性率降低。本发明应用于CRISPR脱靶效应检测领域。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法。

背景技术

在基因治疗、药物发现、靶向基因调控、表观遗传调控、染色质操纵和活细胞染色质成像等广泛领域，CRISPR已被证明是一种高度通用的基因编辑工具，具有巨大的潜力。然而，CRISPR技术的准确性和可靠性受到识别和切割近认知DNA序列到目标位点所造成的脱靶效应的严重阻碍。因此，在给定目标位点的各种候选物中鉴定最佳的gRNA，以及潜在的脱靶位点的定位对于保持安全有效的CRISPR扩增是非常重要的。但是，如何快速筛选最佳的gRNA并敏感地检测所有潜在的脱靶仍然是一个巨大的挑战。

GUIDE-seq是一种在全基因组水平无偏倚性检测CRISPR脱靶效应的方法。它依赖于非同源末端连接(NHEJ)介导的外源供应的双链寡脱氧核苷酸(dsODNs)与CRISPR/Cas产生的DNA双链断裂(DSBs)的整合。因此，GUIDE-seq的敏感性和特异性受dsODN整合效率的影响。而dsODN的整合效率进一步受到DSB类型(钝性末端或粘性末端)、DSB 序列上下游序列以及DNA修复过程中DSB附近的dsODN浓度浓度的影响。并且，由真核细胞有丝分裂过程会产生DNA损伤进而产生背景DSB，这些非DSB切割产生的背景 DSB同样有机会整合dsODN。而这些背景DSB整合了dsODN的位点将被GUIDE-seq检测到，但是是非CRISPR切割产生的假阳性脱靶位点。另一方面，有一些脱靶位点的发生频率很低，低于检测的阈值，即使有dsODN的整合，也同样不会被GUIDE-seq检测到。而上述的这些情况会削弱GUIDE-seq的敏感性和特异性。

因此，优化GUIDE-seq实现全面准确的脱靶检测势在必行。已发表文章iGUIDE对GUIDE-seq进行改进。它应用较长的dsODN(46nt VS.34nt)来减少非特异性扩增，以提高GUIDE-seq的特异性。然而，iGUIDE也依赖于dsODN整合效率，仍然面临上述问题。因此亟需开发新的方法来提高脱靶检测的敏感性及特异性。

发明内容

本发明的目的是为了提高GUIDE-seq检测CRISPR脱靶效应的敏感性和特异性，本发明基于链霉亲和素-生物素系统，开发出GUIDE-pro，并提供一种准确的可批量进行体内脱靶检测及sgRNA筛选的方法，即一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法。

本发明的一种生物素化的dsODN，所述的生物素化的dsODN序列如下：

5’-G*T*TTAATTGAG/iBiodT/TGTCATA/iBiodT/GTTAA/iBiodT/AACGGT*A*T-3’；

5’-A*T*ACCGTTA/iBiodT/TAACATA/iBiodT/GACAAC/iBiodT/CAATTAA*A*C-3’。

本发明采用生物素化的dsODN，利用GUIDE-pro建库用引物序列如下：

P701

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGG GCAGTCGGTGA；

P702

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTCCTCTCTATG GGCAGTCGGTGA；