[发明专利]一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的小分子靶标筛选方法基于靶点响应性可及性变化谱技术，包括：

（1）共价标记：在包含目标小分子作用靶标的生物样本中，利用化学标记试剂共价修饰生物样本蛋白中特定活性氨基酸；

（2）在终止标记过程后，利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较生物样本在缺乏以及存在孵育小分子配体时其中全蛋白组水平各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋白位点的可及性变化；根据变化的倍数及显著性筛选孵育小分子配体导致生物样本中蛋白化学可及性显著变化的位点，将所述位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜在结合和诱导变构的位点。

2.根据权利要求1所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的活性氨基酸为具有化学活性基团的氨基酸，包含赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。

3.根据权利要求2所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的活性氨基酸优选为赖氨酸。

4.根据权利要求3所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，用于标记活性赖氨酸的化学标记试剂为氟苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、磺化NHS、丙烯酸磺酰酯、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、酰亚胺酯、琥珀酸酐、醋酸酐、马来酸酐、2-乙酰苯基硼酸、磺酰卤、环氧化物、氟苯、吲哚及吲哚衍生物、酰基叠氮化物中的一种，或为醛基化合物与还原剂的组合；

所述醛基化合物包括甲醛、乙醛、丙醛；还原剂包括硼烷-吡啶络合物、硼氢化钠、二甲胺硼烷。

5.根据权利要求4所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述甲醛采用氘代甲醛。

6.根据权利要求5所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，氘代甲醛与包含目标小分子作用靶标的生物样品蛋白中特定活性氨基酸的摩尔比为5:1-15:1，更优选为10:1。

7.根据权利要求1所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的定量蛋白质组学技术采用非标定量法或多通道标记定量法，多通道标记定量法包括串联质谱标签TMT定量蛋白组学、相对及绝对定量等重标签iTRAQ定量蛋白组学。

8.如权利要求1-7任一项所述的小分子靶标筛选方法在筛选小分子靶标中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：

（1）通过蛋白鉴定及定量分析软件，根据研究的物种选择Uniprot数据库中与待测生物体系对应种属的蛋白组，设定酶解所用的蛋白酶类别，设定翻译后修饰设置为脲甲基化(半胱氨酸位点,固定)、氧化(甲硫氨酸位点,可变)、氘代二甲基化(赖氨酸位点,可变)、氘代甲基化(赖氨酸位点,可变)，一级质谱MS及二级质谱MS/MS的质量误差范围根据仪器的分辨率及灵敏度设定；

（2）利用蛋白鉴定定量软件对孵育前后含有赖氨酸的肽段被标记试剂标记的比例变化进行分析得到比例变化TRAP Ratio值，并对定量结果进行统计学分析得到统计学分析结果：对通过非标定量法获得的定量结果采用双尾学生t检验统计分析计算p值；对多通道标记定量结果，使用Benjamini Hochberg法计算q值；

（3）从生物体系中根据比例变化TRAP Ratio值及统计学分析结果筛选小分子靶标，筛选标准的设置根据小分子与靶标的亲和力强弱进行调整。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，筛选标准的设置为：

针对活性代谢物及天然产物这些弱结合配体，结合及变构位点筛选标准为非标定量结果所得的肽段可及性变化TRAP Ratio 1.5倍，并且t检验所得p值0.05；多通道标记定量结果的肽段可及性变化TRAP Ratio 1.5倍，所得q值0.03；

针对与靶标存在强亲和力的小分子药物，结合及变构位点的筛选标准为肽段可及性变化TRAP Ratio值2倍，并且t检验分析所得p值0.01；多通道标记定量结果的肽段可及性变化TRAP Ratio 2倍，所得q值0.01。