[发明专利]一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺

说明书

本发明涉及一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺；是在具有固定床篮式搅拌系统的生物反应器中利用片状载体和无血清培养基培养原代鸡胚细胞，通过特定的上罐细胞密度、CTN鸡胚细胞疫苗株—CTNCEC25株（CGMCC No.6510）的接种量和生物反应器设定参数制备高滴度、高抗原的狂犬病病毒收获液。病毒滴度平均不低于7.0 lgFFU/mL，最高可达到8.7lgFFU/mL，抗原含量平均不低于2.0 IU/mL，最高可达4.0 IU/mL，收液可达2‑3个有效培养体积，极大地降低了劳动强度和生产成本，大幅度提高了生产效率，开创了原代细胞大规模培养生产狂犬病病毒的培养方式。

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，应用于原代鸡胚细胞狂犬病疫苗的生产，尤其涉及一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺。

背景技术

狂犬病(Rabies)是一种由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的古老的侵害中枢神经系统、可引起严重脑脊髓炎的烈性人畜传染病，一旦发病，死亡率几乎为100％。几乎所有温血动物都能感染狂犬病，其中尤其以各种哺乳动物为其主要宿主。目前尚无有效的狂犬病治疗方法，暴露后及时接种狂犬病疫苗是最主要的预防手段。

人用狂犬疫苗经过100多年的发展，由最早的减毒活性疫苗，到禽胚疫苗，发展至现在的细胞培养疫苗和处于实验室阶段的基因工程疫苗，疫苗质量和安全性得到极大提高。欧美及日本等发达国家市场的狂犬病疫苗主要为纯化鸡胚细胞疫苗(PCECV)和纯化人二倍体细胞疫苗(PHDCV)。这两种疫苗安全性高、免疫保护效果好，其中PHDCV是WHO确定的人用狂犬病疫苗的金标准，但由于人二倍体细胞的特性使得其生产规模难以放大，导致PHDCV的产量严重不足，最终销售价格居高不下(目前市面上价格约1500元/人份，而Vero细胞苗价格平均约为300元/人份)，制约其市场规模；PCECV的免疫原性和安全性可与PHDCV相媲美，是安全有效的高质量狂犬病疫苗，其市面上价格约1000元/人份，也显著高于Vero细胞苗价格。在发展中国家，因经济发展水平原因，市场上主要的狂犬病疫苗是生产成本较低的纯化Vero细胞疫苗(PVCV)。由于Vero细胞为无限传代细胞系，存在潜在的致瘤风险以及DNA残余问题，成为其未来市场份额的主要障碍，目前欧美等发达国家已基本淘汰PVCV。

目前中国已上市销售的狂犬病疫苗主要有PVCV、PCECV和PHDCV。由于Vero细胞培养工艺简单、成本低廉、方便扩大培养，因此PVRV已经成为中国人用狂犬病疫苗市场的主力军，生产企业众多，占中国批签发狂苗总量的95％左右。然而，因为Vero细胞为传代细胞系，具有潜在的致癌风险，因此PVRV应用的安全性一直备受争议。另一方面，尽管HDCV是国际公认的金标准产品，但HDCV存在严重缺点，即人二倍体细胞增殖慢，疫苗生产过程太长，病毒繁殖滴度较低，加上生产工艺复杂和产量低，因此疫苗的成本高，价格昂贵，较难在发展中国家推广。而PCECV具有较好的免疫保护性，且与HDCV的效果相当，是HDCV理想替代苗。目前PCECV仅有GSK一家进口中国，尚无国内生产厂家生产，而进行PCECV临床申报的国内某企业采用的是细胞工厂生产工艺。细胞工厂工艺虽然较稳定，批次间差异小，但细胞密度低、病毒滴度低、抗原低，收液体积少，劳动强度大，产业化经济效益低下。

目前，细胞工厂培养工艺是较成熟的鸡胚细胞等原代细胞基质培养方法。中国专利公开号CN108452298A的专利，公开了一种用SPF鸡胚细胞生产黄热病减毒活疫苗的工艺，存在培养细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。中国专利公开号为CN1390604的专利，公开了大规模连续生产病毒疫苗的方法，采用的是固定床篮式搅拌系统的CelligenPlus生物反应器，以聚酯切片Fibra-Cel Disks为载体，规模仅为5.0-7.5L，不适合于大规模的狂犬病疫苗生产。

发明内容