[发明专利]基于等温指数扩增的microRNA生物传感器

权利要求书

1.一种基于等温指数扩增的microRNA生物传感器，其制备方法包括以下步骤：

(1)、发卡探针的制备将分别装有HPLC纯化的HP1、HP2和荧光探针核酸链冻干粉的EP管以12000rpm离心5分钟，在此EP管中分别加入180μL、180μL和300μL DEPC水配制成10umol/L的溶液。然后将此EP管置于95摄氏度水浴箱中孵育5分钟，之后关闭水浴箱缓慢下降至室温，从而制备发卡结构探针，将装有所述发卡探针的EP管用锡箔纸包裹后置于-20摄氏度保存。

(2)、指数等温扩增取上述制备的HP1、HP2和荧光发卡探针溶液各0.1μL、0.2μL和2μL与缓冲液混合后得到50μL反应溶液，在反应液中加入待检microRNA，并于37摄氏度下反应90分钟，然后80摄氏度下孵育20分钟。

(3)、信号检测将上述反应后的液体加入到100μL石英比色皿，将比色皿置于荧光分光光度计中，将激发和发射的狭缝宽度设置为5nm，PMT检测器高电压设置为600v，以495nm的光激发样品，并以1nm的步长从510nm至650nm扫描荧光发射检测荧光信号。这样就建立起基于等温指数扩增的microRNA生物传感器。

2.如权利要求1所述的基于等温指数扩增的microRNA生物传感器，其制备方法步骤1中所用的核酸探针均采用HPLC方式纯化。

3.如权利要求1所述的基于指数等温扩增的microRNA生物传感器，其制备方法步骤1中加入装有HP1、HP2和发卡探针EP管中的DEPC水分别为180μL、180μL和300μL，制备成10uM的溶液。

4.如权利要求1所述的基于指数等温扩增的microRNA生物传感器，其制备方法步骤1中发卡探针制备是在95摄氏度孵育5分钟之后缓慢降至室温。

5.如权利要求1所述的基于指数等温扩增的microRNA生物传感器，其制备方法步骤2中各取HP1、HP2和发卡探针0.1μL、0.2μL和2μL到50μL反应液中，反应液中HP1、HP2和发卡探针的浓度分别为20nmol/L，40nmol/L和400nmol/L。

6.如权利要求1所述的基于指数等温扩增的microRNA生物传感器，其制备方法步骤2中反应液成分包括1.25个单位U Klenow fragment DNA聚合酶，5个单位Nb.BbvCI内切酶，500umol/L dNTPs混合液，20nmol/L HP1，40nmol/L HP2，400nmol/L荧光发卡探针、NEBuffer 2(pH 7.9，10mM Tris-盐酸，10mM氯化镁，50mM NaCl和1mM DTT)和CutSmart(pH7.9，20mM Tris-乙酸盐，500mM乙酸钾，100μg/mL BSA和10mM醋酸镁) 。

7.如权利要求1所述的基于等温指数扩增的microRNA生物传感器，其制备方法步骤2中反应液37摄氏度下反应时间是90分钟，然后在80摄氏度下反应时间是20分钟。

8.如权利要求1所述的基于指数等温扩增的microRNA生物传感器，其制备方法步骤3中将检测条件设置为激发和发射的狭缝宽度均为5nm，PMT检测器高电压为600v，激发波长为495nm，并以1nm的步长从510nm 至650nm扫描荧光发射。