[发明专利]一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法，包括取样与样品处理、培养、取其叶片和蔗茎消毒、灭菌、加入液体培养基，注入乙炔气体、封口、再挑选单菌落继续培养，测定其固氮酶活性。本发明通过将测定的甘蔗体样品进行取样与样品处理、培养、取其叶片和蔗茎消毒、灭菌、加入液体培养基，注入乙炔气体、封口、再挑选单菌落继续培养，测定其固氮酶活性，用于测定甘蔗体内的固氮菌固氮酶活性的液体/NFb培养基组成简单、易于配制、成本低，且液体/NFb培养基对甘蔗体内固氮菌的选择性较小，通过不施氮肥和消毒使得试验结果更加准确，防止试验结果差异大，且乙炔的注入量，方便对固氮菌固氮酶活性的检测。

技术领域

本发明涉及测定固氮菌固氮酶活性领域，特别涉及一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法。

背景技术

甘蔗是热带和亚热带地区的重要经济作物之一，甘蔗生物固氮及其应用研究对于甘蔗生产中节约氮肥成本、减少环境污染具有非常重要的意义。在巴西，有些地方连续种蔗50年以上，有的甚至超过100年，在低氮投人(新植蔗60kgN/肼、宿根120kg N/hm2以下)及每造收获时几乎全部植株氮素被带走(每造甘蔗100～200kg N/hm3)的情况下土壤的氮储量并不下降。上世纪50年代到70年代,许多种有固氮能力的细菌在甘蔗体内被发现,到80年代,科学家们用N平衡法研究证实巴西的一些甘蔗品种能从空气中获得相当多的氮素、

固氮酶活性测定是鉴别固氮微生物固氮能力或固氮效能大小的指标。甘蔗生物固氮能力测定常用的有乙炔还原法、氮平衡法、N同位素稀释法、N同位素自然丰度法等。其中乙炔还原法测定固氮酶活性为常用的方法，它具有灵敏度高、且方法简单、速度快等特点，甘蔗生物固氮为联合固氮，植株高大，进入伸长期其固氮能力才能充分。

本发明提供一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法，具体包括如下步骤：

a.取样与样品处理：取6-10份叶的蔗茎带回室内，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，无菌水冲洗、无菌纸除水，去蔗皮，取6份叶蔗茎中部切碎细小均匀，称取样品2g，转入100ml培养瓶中，加培养基至总体积为10ml，用胶塞密封好；

b..将培养后的样品分开进行桶栽，桶内土壤pH 6.0，有机质1.6％，全N含量0.13％.速效N含量55mg/kg，速效P含量24nag/kg，速效K含量188mg/kg，桶内温度为30℃，进行培养；

c.不施氮肥，在宿根伸长期取其叶片和蔗茎，清水洗干净，在超净工作台上先以70％酒精表面消毒，再用0.1％升汞消毒5rain；

d.灭菌水冲洗4次以后.在灭菌过的研钵中磨碎.转人60mL磨口的白小口瓶中，加入液体/NFb培养基，分别依次注入2％、4％、6％和8％的乙炔气体，封口，30℃，120r/mln摇床培养.3d后提取上清液转入新的培养基继续培养，共转接培养4次后，在JNFb固体培养基平板上划线培养；

e.再挑选单菌落继续培养，测定其固氮酶活性；

f.取100uL反应气体在气象相色谱仪中测定乙烯生成量,根据以下公式换算成固氮酶活性，固氮酶活性(nmol/mg*h)＝CH4摩尔数(nmol)/(菌体蛋白量(mg)×反应时间(h))，CH4 nmol＝CH4体积(uL)×273×P/[22.4x(273+t℃)×760]。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤a-f所有操作均在无菌状态下完成。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1：本发明通过将测定的甘蔗体样品进行取样与样品处理、培养、取其叶片和蔗茎消毒、灭菌、加入液体培养基，注入乙炔气体、封口、再挑选单菌落继续培养，测定其固氮酶活性，用于测定甘蔗体内的固氮菌固氮酶活性的液体/NFb培养基组成简单、易于配制、成本低，且液体/NFb培养基对甘蔗体内固氮菌的选择性较小，通过不施氮肥和消毒使得试验结果更加准确，防止试验结果差异大，且乙炔的注入量，方便对固氮菌固氮酶活性的检测。