[发明专利]一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统的构建及其应用

权利要求书

1.一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统载体，其特征在于所述系统载体含Cas9失活蛋白（即dCas9蛋白）、转录激活效应蛋白VP64、抗性选择标记基因、至少一个gRNA支架序列和增强转录激活的特异序列SunTag序列；

所述系统载体以微拟球藻用Cas9表达载体pNOC-ARS-CRISPR作为骨架，其含有内源启动子和终止子，其中，启动子为Ribi双向启动子和LDSP启动子，终止子为LDSP终止子；

所述骨架载体中Ribi双向启动子一端依次连接dCas9蛋白、增强转录激活的特异序列SunTag序列和转录激活效应蛋白VP64；另一端连接gRNA支架序列，其驱动gRNA表达；潮霉素抗性基因位于骨架载体LDSP启动子下游；

所述Cas9失活蛋白、转录激活效应蛋白VP64、抗性选择标记基因、gRNA支架序列和增强转录激活的特异序列SunTag序列分别为经微拟球藻密码子优化后的相应基因序列；其中，密码子优化的dCas9蛋白的编码核酸序列为SEQ ID NO:1中从6279bp到10379bp，密码子优化的转录激活效应蛋白VP64的编码核酸序列为SEQ ID NO:1中从5187bp到5336bp，密码子优化的抗性选择标记基因为SEQ ID NO:1中从2617bp到3642bp，密码子优化的增强转录激活的特异序列SunTag序列为SEQ ID NO:1中从5397bp到6101bp。

2.一种权利要求1所述系统载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)利用骨架载体构建包含有Cas9失活蛋白、转录激活效应蛋白VP64和增强转录激活的SunTag序列的表达载体，并由同一启动子驱动表达；

(2)构建特异的gRNA序列连接到步骤(1)中表达载体，构成转录激活载体，即权利要求1所述系统载体。

3.一种权利要求1所述系统载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)重组质粒的构建：利用骨架载体构建包含有Cas9失活蛋白、启动子和终止子，以及潮霉素抗性基因，将原载体Cas9蛋白失活为dCas9蛋白；

(2)将转录激活效应蛋白VP64和增强转录激活的SunTag序列连接到dCas9蛋白下游，并由同一启动子驱动表达；

(3)将至少一个gRNA支架序列连接到上述重组质粒上，构建获得转录激活载体，即权利要求1所述系统载体。

4.一种权利要求1所述系统载体在微拟球藻的代谢工程改造和合成生物学研究中的应用。

5.一种宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为包含权利要求1所述的系统载体。

6.权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主为海洋微拟球藻。