[发明专利]一种调控番茄抗坏血酸积累的基因及应用

权利要求书

1.一种调控番茄抗坏血酸积累的基因，其特征在于，所述调控番茄抗坏血酸积累的基因的DNA为SEQ ID NO：1。

2.一种利用权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2.

3.一种利用权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因构建的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGBKT7，DNA序列为SEQ ID NO：3。

4.一种如权利要求3所述表达载体的构建方法，其特征在于，所述表达载体的构建方法包括：

以番茄A57叶片cDNA为模板进行PCR扩增，得到F-Box基因全长ORF，连接到中间载体pEASY-B上，通过热击转化入大肠杆菌，扩繁后菌液PCR检测并挑选条带大小正确的单克隆测序验证；测序正确的抽取其质粒，并用EcoRI和SalI对pGBKT7空质粒和pEASY-B重组载体质粒进行双酶切回收；

将回收的基因片段通过T4 DNA连接酶连接到线性pGBKT7载体上，构建pGBKT7-F-Box重组质粒；将连接产物通过热激转入大肠杆菌，并用含50mg/L Spec抗性的平板涂皿筛选单克隆，挑选单克隆在50mg/L Spec液体LB中，37℃200r/min摇床上扩繁，菌液PCR检测后挑选正确抽提质粒用于下一步酵母的转化。

5.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在番茄抗坏血酸含量测定上的应用，其特征在于，所述在番茄抗坏血酸含量测定上的应用包括总抗坏血酸含量的测定和还原态抗坏血酸含量的测定；

总抗坏血酸含量的测定包括：

取上清20μL于酶标板中，加入20μL,5mM的DTT，离心混匀后置于37℃反应20min；

向反应溶液中加入10μL 0.5％的NEM溶液，离心混合后室温下放置1min；

加入80μL The Color Reagent，离心混匀后于37℃反应1h，在550nm波长下测定其吸光值；

所述还原态抗坏血酸含量测定包括：

取上清20μL于酶标板中，加入30μL磷酸缓冲液；

加入80μL The Color Reagent，离心混匀后于37℃反应1h，在550nm波长下测定其吸光值。绘制标准曲线：用抗坏血酸标样配置成初始浓度为1mg/mL的标准溶液，用6％的三氯乙酸按浓度稀释成不同浓度的溶液，按照还原态抗坏血酸测定方法分别在550nm波长下测定其吸光值，绘制成标准曲线。

6.一种如权利要求1所述调控番茄抗坏血酸积累的基因在叶绿素含量测定上的应用，其特征在于，所述在叶绿素含量测定的应用包括：

用液氮取样并将样品于液氮中研磨至粉状，称取粉状样品定量至0.2g于2mL离心管中；

向离心管中加入1.5mL浓度为80％的丙酮溶液，并立即混匀并置于黑暗处使样品充分抽提1h；

将试管置于离心机离心，12000r/min，10min；

吸取200μL上清于酶标板中，用酶标仪在波长646nm和663nm下分别测定样品吸光值；

使用叶绿素浓度计算公式计算叶绿素含量；

叶绿素浓度(mg/mL)＝17.32A₆₄₆+7.18A₆₆₃，A表示相关波长下的吸光值。