[发明专利]基于一水蓝铜矾的固定和偶联蛋白复合材料及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种基于一水蓝铜矾的高效固定和偶联蛋白复合材料及其制备方法和应用，在含有两种蛋白(辣根过氧化物酶和链霉亲和素)的硼酸‑氯化钾缓冲液中，加入硫酸铜，在室温条件下即可反应形成用一水蓝铜矾来固定和偶联蛋白的复合材料。本发明中所设计的复合材料的合成与蛋白固定和偶联可通过一步反应实现。合成条件简单、绿色、温和且没有复杂的纯化和操作步骤。同时，该复合材料上所固定的大量辣根过氧化物酶和适量链霉亲和素分别具有信号放大和生物识别的作用，可应用于酶联免疫吸附试验检测转基因蛋白Cry1Ab或其他生物分析物。

技术领域

本发明属于纳米材料和生物分析检测领域，具体涉及一种基于一水蓝铜矾的高效固定和偶联蛋白复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

在酶标免疫分析法中，常需要事先把信号蛋白(如酶)与识别蛋白(如链霉亲和素、抗体等)偶联后，再来用于抗原抗体反应，然后通过酶与底物产生颜色反应，通过颜色吸光值的强度与待测物的浓度之间的关系来建立标准曲线，用于定量测定某种分析物，如酶联免疫吸附试验(ELISA)。传统的ELISA方法中有两个有待改进的地方。其一，在进行蛋白与蛋白之间的偶联时，常使用化学交联法，即利用交联剂将两种蛋白通过形成共价键连接在一起的一种化学方法。而交联剂一般多为有机试剂，所涉及的反应条件较为苛刻，且操作复杂，纯化步骤多，耗时长。如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。其二，传统的ELISA方法中，结合在分析物上酶分子的数量相对较少，酶所催化产生的信号强度在一定程度上受到了限制。研究者一般会设法增加结合在分析物的上酶分子数量，来实现信号放大，进而提高检测的灵敏度。

由于纳米材料的超高的比表面积，使得纳米材料可以作为一种载体用于固定大量的酶分子(信号蛋白)来实现信号放大，同时也会固定一定量的链霉亲和素、抗体等(识别蛋白)用于生物识别。但是，使用纳米材料固定蛋白也存在两方面问题。其一，纳米材料的选择与操作复杂性问题，现有的纳米材料如纳米金、碳类纳米材料、金属氧化物材料(钛、铝、锆等)、硅类纳米材料、多聚物等，虽然这些材料都能够很好的进行蛋白的固定，但是蛋白的固定一般都需要在纳米材料的合成完成之后才能进行。也就是说，纳米材料的合成与蛋白的固定是分步进行的，这给操作增加了复杂性。其二，蛋白在纳米材料上的固定化效率问题。固定方式一般有两类：一类是物理吸附，一类是化学键固定。物理吸附是通过纳米材料与蛋白进行物理混合，利用如氢键、π-π堆积、范德华力、静电和疏水相互作用等作用力将蛋白吸附于纳米材料表面，虽然方法简单，但由于作用力小，蛋白的固定不够稳定，容易泄露。化学键固定会使用共价键来连接蛋白与纳米材料载体，所以固定会比较牢固，但是步骤繁琐，试剂繁多而且还会造成一定的蛋白活力损失。所以，如何简化固定方式和整体操作，高效固定的同时不造成蛋白活力的降低，是纳米材料应用于酶标免疫分析中的核心问题，也是当前的瓶颈性问题。

发明内容

为解决上述存在的问题，本发明提供了一种基于一水蓝铜矾的高效固定和偶联蛋白复合材料及其制备方法，所设计的复合材料的合成与蛋白固定和偶联可通过一步反应实现。合成条件简单、绿色、温和且没有复杂的纯化和操作步骤，且高效固定蛋白的同时不造成蛋白活力损失。

另外一个目的是，所得的复合材料上所固定的大量辣根过氧化物酶和适量链霉亲和素分别具有信号放大和生物识别的作用，可应用于酶联免疫吸附试验检测转基因蛋白Cry1Ab或其他生物分析物。

为了实现上述目的，本申请采用以下技术方案：基于一水蓝铜矾的固定和偶联蛋白复合材料的制备方法，包括以下步骤：

S1将辣根过氧化物酶和链霉亲和素溶解在缓冲液中；

S2在步骤S1所得的溶液中加入硫酸铜溶液进行反应，然后将产物离心分离出来并洗涤，即得到基于一水蓝铜矾的固定和偶联蛋白复合材料。