[发明专利]一种精确定量检测自噬流的方法

说明书

本发明公开了一种精确定量检测自噬流的方法，步骤如下：(1)构建EGFP/LC3HIBIT共表达载体，EGFP和LC3HIBIT分别用于独立的启动子，互不影响；(2)通过瞬转或筛选单克隆的方法，获得EGFP和LC3‑HIBIT蛋白的共同表达的细胞；(3)筛选单克隆稳转细胞后，可在此细胞的基础上进行与自噬相关的各种遗传操作，及筛选自噬相关药物等；(4)在多功能酶标仪上设置程序分别测定发光和荧光读值，以EGFP为该实验中的内参，校准因细胞差异导致的HIBIT读值，从而准确反映细胞的自噬程度。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种精确定量检测自噬流的方法。

背景技术

自噬是细胞内物质进行周转的重要过程。细胞可以通过自噬和溶酶体，消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质与核酸等生物大分子。为细胞的重建、再生和修复提供必须原料，实现细胞的再循环和再利用。它既是体内的「垃圾处理厂」，也是「废品回收站」；它既可以抵御病原体的入侵，又可保卫细胞免受细胞内毒物的损伤。

LC3B是细胞自噬过程中的关键基因。在细胞内LC3B被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切生成胞质的LC3-I,然后通过磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-II，并定位于自噬体的外膜和内膜。自噬体与溶酶体融合后，膜内结合的LC3-II被溶酶体蛋白酶降解。因此目前常用自噬标志物LC3的转换即LC3-II/LC3-I的比例检测细胞的自噬程度。

Promega公司在2017年开发出了HIBIT标签细胞，并把它应用与自噬的研究。如图1所示，通过外源表达载体使得细胞中表达的自噬LC3附带HiBiT报告基并在自噬诱导后成为吞噬体的靶向。自噬体腔内捕获的携带报告分子HIBIT的LC3-I蛋白，随后在自噬体形成时降解。最后通过HiBiT检测试剂盒检测其表达情况。

通过Autophagy LC3 HIBIT质粒的转染获得LC3-HIBIT瞬时表达，或筛选出稳定表达LC3-HIBIT的细胞株能够测定细胞自噬流的变化。但此技术还存在明显缺陷：

1、在使用瞬时转染时无法保证每次的转染效率一致，因而无法确定所测定到的HIBIT发光读值差异是来自于实验处理还是来自于实验中不一样的细胞转染效率。

2、在非单克隆的稳定转染的细胞株中，细胞进行裂解，无法保证每个样本之间的裂解效率一致，即无法确定所加样本HIBIT读值的变化是来自于实验处理的不同还是来自于检测系统的误差。

3、现有的LC3-HIBIT检测系统只能用来做单一变量的实验检测…

总之，由于缺乏内参对照，现有的LC3-HIBIT检测系统使用范围窄，且无发精确的测定细胞内LC3的变化情况。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种精确定量检测自噬流的方法，解决现有的方法无法排除组间读值引起的系统误差，导致应用范围严重受限的问题。

本发明的技术方案为：一种精确定量检测自噬流的方法，包括如下步骤：

(1)构建EGFP/LC3 HIBIT共表达载体，EGFP和LC3 HIBIT分别用于独立的启动子，互不影响。

(2)通过瞬转或筛选单克隆的方法，获得EGFP和LC3-HIBIT蛋白的共同表达的细胞。因为EGFP和LC3-HIBIT在同一个质粒上其初始的表达具有固定的比例关系，而且在瞬时转染中EGFP可以代表转染效率；在稳转细胞中EGFP可以表示细胞的数目。

(3)筛选单克隆稳转细胞后，可在此细胞的基础上进行与自噬相关的各种遗传操作，及筛选自噬相关药物等；

(4)在多功能酶标仪上设置程序分别测定发光和荧光读值，以EGFP为该实验中的内参，校准因细胞差异导致的HIBIT读值，从而准确反映细胞的自噬程度。