[发明专利]一种野生树舌灵芝RNA提取方法

说明书

本发明公开了一种野生树舌灵芝RNA提取方法，包括：采用磁珠、活性炭、β‑巯基乙醇及4M异硫氰酸胍等对树舌灵芝子实体进行破碎裂解，再对RNA进行抽提和纯化；采用本发明提取的RNA完整性好、纯度高、浓度高，完全可以满足建库要求。

技术领域

本发明涉及RNA提取方法技术领域，尤其是一种野生树舌灵芝RNA提取方法。

背景技术

树舌灵芝又称树舌扁灵芝、老母菌、枫树菌，子实体大型或特大型，无柄或几乎无柄；菌盖呈半圆形、扁半球形或扁平，表面灰色，渐变褐色，有同心环纹棱，有时有瘤，皮壳胶角质，边缘较薄，是重要的木腐菌之一；其成分中包括多糖、甾体化合物、三萜、脂类、氨基酸、多肽、蛋白质类、生物碱类、酚类、内酯、香豆素类和甙类以及微量元素等。

树舌灵芝是大自然赏赐给人类的重要药材资源，作为一种药用真菌，它为人类治疗疾病发挥着重要作用。在中国和日本民间作为抗癌药物，除此之外，还可以治疗风湿性肺结核，有止痛、清热、化积、止血、化痰之功效，其药用价值越来越受到人们的关注。

树舌灵芝，在真菌界属于大型真菌，其体积硕大，形状千姿百态，不加雕琢，就可以成为人们的欣赏对象。树舌灵芝的菌管口面，在新鲜时一般呈灰白色，如果细心保护，就是艺术创作的天然的画布。趁着新鲜直接进行的艺术描绘，因其菌丝体的褐色，显得非常古朴、自然，树舌灵芝干燥以后，依然可以净如白纸，在这里进行的彩色描绘，也会得心应手，巧夺天工，达到大自然的美和艺术的美的完美结合，是艺术创作的又一奇葩。

由于其特殊的药用价值及艺术价值，因此对树舌灵芝的转录组进行分析，对于了解该真菌的药用机理及其特有的艺术形态将有着重要的意义。

发明内容

本发明公开了一种野生树舌灵芝RNA提取方法，提取的RNA完整性好、纯度高、浓度高，完全可以满足建库要求。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种野生树舌灵芝RNA提取方法，包括以下步骤：

S1. 将树舌灵芝子实体用无菌水清洗干净，用滤纸吸干表面的水，切成块后称取菌肉，加入磁珠和活性炭，再加入菌肉重量3%~6%PVPP，在液氮中迅速研磨成粉末，转移到离心管中，分别加入β-巯基乙醇及4M异硫氰酸胍，立即涡旋剧烈震荡混匀，静置1~5min后加入Trizol混匀，菌肉、β-巯基乙醇、异硫氰酸胍和Trizol的质量体积比为1g:50~70μL:400~600μL:1~3mL；

S2. 离心，吸取上清液至新的RNase-Free的离心管中；

S3. 缓慢加入与上清液等体积的无水乙醇和1/4~1/6体积3M醋酸钠水溶液，混匀，待出现白色沉淀完全；

S4. 离心，弃上清液，用75vol.%乙醇洗涤1-2次，加入TE缓冲液溶解，再加入DNase I混匀，离心，倒掉上清液后，加入TE缓冲液，第一次加入的TE缓冲液、DNase I、第二次加入的TE缓冲液按照每1g菌肉计算，分别为4~6ml、80~150 μL和2~5ml；

S5. 加入与步骤S4第二次加入的TE缓冲液等体积的氯仿和异戊醇混合液，氯仿和异戊醇的体积比为20~25:1，混匀，室温放置10~20 min，离心，弃去上清液，取沉淀物；

S6. 沉淀物用75 vol.%乙醇洗涤，在超净工作台上风干，溶于灭菌水或TE中，于-20℃保存。

优选的，所述步骤S1中，涡旋剧烈震荡混匀后，加入纤维素酶和果胶酶的混合液静置4~5min；所述纤维素酶和果胶酶分别溶解于0.1mol/L的醋酸钠水溶液中再混合得纤维素酶和果胶酶的混合液。更优选的，菌肉与纤维素酶和果胶酶的混合液的质量体积比为1g:3mL，纤维素酶的质量浓度为20g/L，果胶酶的质量浓度为20g/L。