[发明专利]一种FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体及其应用

权利要求书

1.一种FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体，它是采用基于FoMV的VOX方法表达的GFP-TaATG8a，能够在激活自噬的细胞中定位于自噬膜，可用于根和叶细胞中自噬活性的监测。

2.权利要求1所述FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体的构建方法，其特征在于使用基于FoMV的VOX载体构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体，设计合成引物Fo-G8a-F和Fo-G8a-R，使用该引物对，以GFP-TaATG8a融合基因表达载体pGFP-G8a为模板，扩增GFP-TaATG8a片段，将扩增片段替换基于FoMV的VOX载体上ClaI和XbaI之间的GFP片段，从而构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体pFo-GFP-TaATG8a，通过插入片段的PCR扩增和DNA测序对构建载体的正确性进行确认；所述的引物序列为：

Fo-G8a-F ACAGTCGACAGCTATATGGTGAGCAAGGGCGAG和

Fo-G8a-R GCGGTCGTTGAGTGTCTAGAGCAATCCGAAGGTGT，

下划线序列是引物5’端添加的目标载体插入位点两侧的同源臂。

3.权利要求1所述FoMV病毒介导的GFP-ATG8表达载体在监测小麦自噬水平上的应用。

4.权利要求3所述的应用，其方法包括以下步骤：

（1）GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体构建：使用基于FoMV的VOX载体构建GFP-TaATG8a融合基因的VOX载体，设计合成引物Fo-G8a-F和Fo-G8a-R，使用该引物对，以GFP-TaATG8a融合基因表达载体pGFP-G8a为模板，扩增GFP-TaATG8a片段，将扩增片段替换基于FoMV的VOX载体上ClaI和XbaI之间的GFP片段，验证插入片段的正确性后，将构建好的载体转化的农杆菌GV3101（pSoup-p19）的化学感受态细胞中；

（2）烟草叶片agroinfiltration：将固体培养基上生长的农杆菌单菌落接种于3 ml含50 μg/ml卡那霉素和25 μg/ml利福平的LB液体培养基，29 ℃震荡培养过夜，按1%的比例接种到扩大培养液中培养，继续震荡培养12 h，离心收集菌体后将菌体悬浮于适量MMA溶液，菌体浓度调至OD₆₀₀值约为0.5，29℃条件下静置3 h，使用1 ml去掉针头的无菌注射器将农杆菌悬浮液从背面注射至烟草叶片中，注射后的烟草于黑暗条件下保存24 h后转移到正常条件下生长，注射农杆菌7 d后，将注射过的烟草叶片在研钵中用液氮研磨成粉末，按1:2（W/V）的比例加入预冷的20 mM PBS缓冲液（pH=7.2）制备成含病毒的烟草汁液，烟草汁液可直接用于小麦接种或保存于- 80℃冰箱；

（3）小麦植株的病毒摩擦接种：按1%（W/V）的比例在烟草汁液中添加灭菌的硅藻土配成病毒接种液，将接种液摩擦接种于两叶期小麦幼苗第二叶，接种后对幼苗进行超纯水喷雾处理和套袋保湿24 h，随后置于正常条件下培养；

（4）饥饿和药物处理：使用无针头的1 ml注射器将100 μM E-64D或1% DMSO（溶剂对照）直接从烟草叶片背面或从小麦叶片背面主脉切口处注射到组织中，然后将叶片剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理，将小麦根部剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理，蒸馏水中添加终浓度1 μM刀豆素A（concanamycin A）或1%DMSO（溶剂对照）；

（5）自噬小体观察：使用体式荧光显微镜、普通荧光显微镜或激光共聚焦荧光显微镜观察叶片和根组织中的GFP荧光。

5.权利要求3所述的方法，其中所述步骤（1）中所述的VOX载体上含有35S启动子驱动的FoMV基因组RNA对应的 cDNA，病毒基因组上设计因两个重复的亚基因组启动子，并且在它们之间克隆有报告基因GFP。

6.权利要求3所述的方法，其中所述步骤（1）中所述的GFP-TaATG8a片段扩增使用的是高保真聚合酶。