[发明专利]用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用

说明书

本发明公开了用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用。发明人通过自有技术，优化得到的了用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组实验数据表明该引物具有很好的扩增效果，可以高效地扩增得到需要的长片段基因，大大简化了地中海贫血的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因扩增领域，具体涉及用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用。

背景技术

地中海贫血(Thalassemia，简称地贫)是一种严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，常见的类型为alpha地贫(α-地贫)和beta地贫(β-地贫)。在我国，该病主要在长江以南大部分省区，特别是广西、广东和海南等省区。α-地贫发生率约为4-15％，β-地贫发生率约为1-6％。目前地贫检测主要通过大规模的人群筛查，以及出于医疗目的的在医疗机构设立的个体检查。这两种检查手段为传统方法，如PCR电泳检法、反向点杂交、荧光定量PCR、sanger测序等。传统方法一般针对高发的已知突变位点，后来为了扩大地贫突变检测位点，研究机构不限于高校、医院等均开始借助高通量测序平台进行更多位点、更高通量的检测，比如芯片捕获方法、多重PCR方法。

目前用于地贫检测的传统方法，仅能检测已知的突变位点，且同时可检测的位点数量少，检测通量低。而高通量检测方法比如芯片捕获方法、多重PCR方法等使用的测序平台存在弊端：测序读长短，且地贫基因区域序列复杂，存在高重复高GC区，而短片段测序无法跨越重复区域，即在高重复区域短片段测序结果并不能拼接完整的单体型，且NGS测序在高GC区域表现较差，存在测序错误率高或者无法读取碱基序列的缺陷。因此使用短读长对地贫基因序列测序存在显而易见的缺点。

长片段PCR中用两种DNA聚合酶进行反应，一种是用常规PCR反应中应用的耐热DNA聚合酶(常用Taq酶)，它具有很强的延伸能力，依赖此酶进行链的延伸。另一种是具有3′→5核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶(常用Pfu酶)，它具有较好的校读功能，可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点，充分利用第一种酶的延伸能力和第二种酶的校读功能，使两种酶在反应中相辅相成，完成长片段DNA的扩增。使用长片段PCR可以直接扩增得到片段长度在5kb以上的序列，直接覆盖部分基因缺失，可以克服传统地贫检测的一些不足。然而地贫基因组所在的区域存在重复性序列、高GC含量、复杂空间结构等特性，尤其是HBA基因存在几kb的重复性序列且部分区域GC含量高达60％。普通长片段PCR(Long-PCR)体系难以扩增大于55％GC含量序列，尤其是难以扩增5kb以上高GC含量序列。这限制了地中海贫血的检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

用于检测地中海贫血基因的长片段PCR引物组，所述引物组的序列包括如下引物对中的至少一对，优选包括HBA的4对引物、HBB的4对引物，或全部8对引物：