[发明专利]一种基于内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于内源CRISPR‑Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统。本发明的人工设计的CRISPR array由启动子、两个重复序列、引导寻找靶位点的一个spacer序列和终止子序列组成。本发明不需要再额外表达Cas基因，仅需要构建携带CRISPR array和两个重组臂的质粒即可完成基因编辑目标，过程简单、效率高，为丁酸梭菌基因功能的验证和高性能益生菌株的构建提供了平台。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统及其应用。

背景技术

丁酸梭菌是一种新型产芽孢益生菌，具有维护肠道微生态平衡的作用。丁酸梭菌在提高机体免疫力、抗癌抗肿瘤等方面也有一定的作用，但具体分子机制仍不清楚。因此需要对丁酸梭菌的代谢通路进行系统性改造，以解析其益生机理、提升其益生效果。

丁酸梭菌属于厚壁菌门，是较难改造的细菌之一，因而适用于丁酸梭菌的基因改造方法非常有限。CRISPR-Cas系统是细菌和古菌内的一种RNA介导的免疫系统，可被改造为高效的基因编辑工具。来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9系统已被成功应用于包括植物细胞、动物细胞、酵母菌、细菌等许多生物中。但由于丁酸梭菌转化效率很低，且CRISPR-Cas9系统本身对细胞具有一定的毒性，因此该系统在丁酸梭菌中的应用受到很大的限制。

丁酸梭菌的内源CRISPR-Cas系统可通过内源Cas蛋白和能与靶位点DNA结合的spacer序列完成对外源入侵因子DNA的切割。但要利用该系统开发基因编辑工具，实现内源CRISPR-Cas系统对丁酸梭菌自身基因组的编辑，需要确认该内源CRISPR-Cas系统所识别的protospacer adjacent motif（PAM）序列和引导寻找靶位点的spacer序列的长度。另外，由于丁酸梭菌转化效率较低且CRISPR-Cas系统的表达会进一步降低转化效率，因此应选择合适的启动子，特别是严谨的诱导表达启动子，来启动CRISPR-Cas系统的表达，以保证转化成功。本发明成功解决了上述问题，并建立了一种高效的基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的基因编辑工具，在丁酸梭菌代谢工程改造中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是在丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的基础上建立针对丁酸梭菌的基因编辑工具，该工具构建简单，转化效率高，能够对丁酸梭菌基因组进行高效的基因编辑。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框从5’至3’方向依次包括：

启动子-重复序列-间隔序列-重复序列和终止子，其中，所述间隔序列来自靶基因，为自靶基因中的任意PAM序列的3’端下游的34-37bp长度的序列，所述PAM序列为5’-ACA-3’或5’-TAA-3’。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其中，所述启动子为乳糖诱导启动子，所述终止子为CA终止子。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其中，所述重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明的基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因组编辑载体，包括上述丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框。

根据本发明的技术方案，间隔序列引导Cas蛋白寻找靶位点，Cas-间隔序列复合体与靶位点结合后，Cas蛋白还会去识别靶位点5’端的PAM，如果PAM正确，则靶位点被切割；但是如果PAM不匹配，则不会切割。间隔序列长度低于34 bp会降低基因编辑效率，例如间隔序列长度为31 bp，基因编辑不成功。

本发明筛选得到有效的PAM序列为 ACA和TAA，PAM序列在基因中的位置也是没有特殊的要求。