[发明专利]基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增快速检测SARS-COV-2的试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增快速检测SARS‑COV‑2的试剂盒，其基于逆转录环介导恒温扩增(RT‑LAMP)反应扩增SARS‑COV‑2的N基因和/或orf1ab基因，配合pH指示剂，标识扩增反应体系中的pH变化，可通过颜色变化判断对应基因的扩增与否，从而实现对SARS‑COV‑2的快速、低成本检测。

技术领域

本发明涉及一种利用逆转录环介导恒温扩增技术并结合pH指示剂进行颜色判定，从而快速检测SARS-COV-2核酸的方法和试剂盒。

背景技术

COVID-19的检测主要依靠医学影像学及分子学，在分子学检测方面又大致分为病毒分离培养、血清抗体与核酸检测三大类。SARS-CoV-2的基因组为单链RNA，长度约为29891bp。核酸检测作为SARS-CoV-2目前主要的检测手段，广泛应用于疑似病人的筛查、治愈情况的核实以及环境检测中。目前广泛应用的核酸检测方法为荧光定量探针法，它使用荧光定量PCR仪实时采集核酸探针在DNA合成过程中被切割产生的荧光信号，具有高灵敏度、高特异性的特点，但对设备要求高、操作相对复杂。

LAMP(loop-mediated isothermal amplification)扩增技术是一种灵敏的恒温核酸扩增方法，它利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，使用针对待扩增区域6个位点设计的4-6条引物进行DNA扩增。在扩增过程中形成不同长度的茎环状结构，以其为模板引物杂交或模板3’端反折都可以作为核酸置换扩增的起始点，在Bst DNA聚合酶的作用下合成新的茎环状产物，由此循环往复，可在30min-60min内合成大量的核酸产物。RT- LAMP是在LAMP的基础上加入了反转录酶，可以将RNA反转录成cDNA后直接扩增，从而将模板范围从DNA扩展到了RNA。LAMP、RT-LAMP技术具有对设备要求低、特异性较高、操作简单(提供60℃-65℃恒温即可)的优点。

已有论文报道建立了基于RT-LAMP检测SARS-CoV-2的方法。其中Laura ED et,al报道的方法主要使用荧光激发及电泳检测，但荧光与电泳都需要额外的设备，并且电泳方式造成了极大的交叉污染风险。其他基于RT-LAMP的检测中，使用了商业化的试剂盒，价格昂贵(约24元/反应孔)，不适于进行大规模的SARS-CoV-2检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测引物。

该检测引物包括用于特异扩增SARS-COV-2 N基因部分片段的RT-LAMP引物和/或用于特意扩增SARS-COV-2 orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物；

所述特异扩增SARS-COV-2 N基因部分片段的RT-LAMP引物为LAMP-N-F3、 LAMP-N-B3、LAMP-N-FIP、LAMP-N-BIP、LAMP-N-LF及LAMP-N-LB，对应引物的序列如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7及 SEQ.ID.NO.8所示；

所述特异扩增SARS-COV-2 orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物为 LAMP-orf1ab-F3、LAMP-orf1ab-B3、LAMP-orf1ab-FIP、LAMP-orf1ab-BIP及 LAMP-orf1ab-LF，对应引物的序列如SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、 SEQ.ID.NO.12及SEQ.ID.NO.13所示。

本发明的目的之二是提供一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测试剂盒。

该试剂盒包括用于通过改变扩增反应体系颜色从而显示SARS-COV-2核酸阳性扩增结果的pH指示剂，以及上述特异扩增SARS-COV-2 N基因部分片段的RT-LAMP引物和 /或上述特异扩增SARS-COV-2 orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物。