[发明专利]一种重组IL2在毕赤酵母中的生产方法

说明书

本发明公开了一种重组IL2在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：步骤S1：重组质粒构建；步骤S2：感受态细胞制备；步骤S3：质粒的线性化；步骤S4：电转化；步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；步骤S7：放大纯化；在基因合成的过程中对IL2的基因进行了密码子的优化，且后期的表达小试进行了最优克隆的筛选及最优表达时间的优化，因此极大地提高了该蛋白的表达量，在载体构建中使用了无缝克隆的技术，从而使得重组IL2在pPICZαA载体中表达出tag free蛋白，后期使用疏水相互作用层析，缩短纯化流程，低温操作，从而极大地保障了蛋白活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组IL2在毕赤酵母中的生产方法。

背景技术

白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能，白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用，白细胞介素interleukin缩写为IL，功能关系免疫反应的表达和调节，这种调节有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等的许多因子参与。来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同(例如巨噬细胞活化，促进T细胞繁殖等)，因子自身的物理化学性质多不清楚，本研究通过毕赤酵母成功表达并纯化得到重组IL2，为该蛋白的后续的研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组IL2在毕赤酵母中的生产方法。

本发明要解决的技术问题：

现有的重组IL2在制备过程中蛋白表达量低，且纯化时间较长，纯化效果一般。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种重组IL2在毕赤酵母中的生产方法，包括如下步骤：

步骤S1：重组质粒构建；

步骤S2：感受态细胞制备；

步骤S3：质粒的线性化；

步骤S4：电转化；

步骤S5：阳性克隆的菌落PCR鉴定及克隆的小量转接；

步骤S6：阳性克隆的诱导及小量表达测试；

步骤S7：放大纯化。

进一步，步骤S1的具体步骤如下：

步骤S11：通过基因合成技术将重组IL2密码子优化后亚克隆至pPICZαA中，构建重组IL2质粒；

重组IL2质粒的基因序列为：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLCLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTVD*。

进一步，步骤S2的具体步骤如下：