[发明专利]结直肠癌类器官的培养方法和培养液

说明书

本发明涉及了一种结直肠癌类器官的培养方法和培养液。本发明的培养基用自产Wnt‑3a、R‑Spondin1和Noggin的细胞系替代三种昂贵细胞因子的加入，对比文献中类器官培养基配方最大限度地节约了类器官培养的成本，且成功率达到90％以上。本发明的培养液，能够培养来源于患者结直肠来源的肿瘤组织。所述培养方法操作简便，五天即可传代，五天之内可不用频繁换液，也减少了操作的繁琐和节约了成本。

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体地涉及一种结直肠癌类器官的培养方法和培养液。

背景技术

癌症治疗的主要挑战是确定一种局部疾病是否会发展成恶性表型，以及如何根据疾病的类型和阶段进行最佳的“匹配”治疗。现在人们普遍认为，对于许多癌症来说，它们不再是一种单一类型的疾病，而是一组癌症类型，根据组织学病理分类，对药物的反应不同。多年来，基础癌症研究和抗癌药物开发利用原代癌细胞和体外培养的细胞系在组织培养皿中培养。虽然这种方法产生了许多目前使用的抗癌药物，但最近的研究发现，这种方法在体内模拟肿瘤生长效果不佳。在大多数情况下，二维(2D)培养,就像在培养皿中进行的培养，无法复制肿瘤的微环境：一个由基质细胞、细胞外基质(ECM)成分，和一个混合信号因子组成的复杂的空间，药物扩散动力学差异很大，2D有效的药物剂量对患者来说通常是无效的，细胞-细胞/细胞-基质的相互作用是不准确的。培养皿的细胞与分离肿瘤的组织有三个主要区别：表面形貌、表面硬度和2D而非3D的结构。因此，2D培养对细胞施加了选择性压力，这可能极大地改变细胞的分子和表型特性。实验室细胞培养和天然组织之间的这些差异导致许多药物在实验室最初有效，但在病人身上测试时却出乎意料地无效和/或有毒。

因此，为了在生理上提供一种比2D细胞培养更相关的选择，三维(3D)细胞培养被开发出来。通过考虑至关重要的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用，3D培养允许细胞复制组织中存在的几个关键特征，包括形态、分化、极性，增殖率，基因表达谱和基因组谱，和肿瘤细胞异质性和营养和氧梯度。重要的是，3D细胞培养跨越了2D细胞培养和动物模型之间的鸿沟：3D细胞培养模型包含了生理上相关的相互作用，同时仍然能够方便地进行遗传操作、生化分析和成像。通过提供一个可复制的、可控的微环境来模拟体内条件，3D细胞培养已经成为一种有效的替代动物模型的方法。此外，由于能够创建三维设计微环境，3D细胞培养可以研究有机生命体中难以解决的问题。

自20世纪70年代首次以漂浮胶原凝胶的形式被使用以来，3D细胞培养系统已经有了很大的发展，目前仍在发展和改进中，其最终目标是在培养中再造整个器官。许多科学界的科学家已经贡献了工具和技术，如生物工程材料、纳米技术、微流体和3D生物打印，以在多个层次和尺度上精确地操纵和控制细胞微环境(其化学、几何和力学)。这些进展导致了无数的三维细胞培养系统的创造，这些系统主要是根据科学家的特殊需要而研发设计的。

结直肠癌是目前世界上癌症引发死亡的主要因素之一。据已有的报道发现，结直肠癌是全球第三大最常见的恶性肿瘤，预计到2030年，结直肠癌新增病例将超过220万，癌症死亡人数将达到110万。大约有20％的结肠癌病人在诊断时已为晚期，失去手术机会，导致结直肠癌患者死亡的主要原因是远端转移。目前阻碍临床转化的问题是许多癌症模型不能很好地重现患者肿瘤的异质性，导致各种化疗药、小分子抑制剂或者靶向药最终在临床实验中以失败告终。导致失败的主要原因是目前普遍使用的肿瘤细胞系模型和异种移植动物模型所存在的不足，例如，单层细胞培养缺乏多样化的细胞类型、空间组织性和体内整体微环境，无法模拟个体间的肿瘤异质性，而动物模型虽然能在一定程度上模拟体内的情形，且能反映各系统间的相互作用，但移植成功率低、培养周期长和成本高等缺点使其难以应用于临床。由此，兼具两者优势的类器官研究近年来成为一个新的研究热点。

类器官是由多种器官特异性细胞类型组成的三维培养体，可以重现其结构和基因表达谱，以及相应器官的一些关键特征和功能。类器官技术被评为2017年生命科学领域的年度技术。目前这项技术由于成本高，操作复杂和技术难度大和而并没有普及使用。因此，有需要开发一种低成本，简便并且成功率可低温冷藏的体外类器官培养方法。

发明内容