[发明专利]检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法

说明书

本发明提供了一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法，引物的序列中上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示；探针的序列为如SEQ ID NO.3所示；试剂盒包括引物、探针、缓冲液和纯化水，RAA检测方法：提取样品DNA，以样品DNA为模板，利用试剂盒进行RAA扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测；本发明的实时荧光RAA检测方法的特异性达100％，灵敏度达8.0×10¹cfu/mL，15min内可得到结果，比实时荧光PCR方法更快速。该方法简便、快速、灵敏、便携、价格低廉，可用于疾病监测、食品安全检测，适合基层实验室推广应用。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

大肠埃希氏菌O157是肠出血性大肠埃希氏菌最重要的一群，具有极低的感染剂量(小于100个细胞)，可导致腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症等。自首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，O157引起的疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大和日本等多个国家引起腹泻爆发和流行。目前已发现可通过多种食物传播，包括香肠、未消毒的牛奶、生菜、香瓜、苹果汁和萝卜苗等。传统的O157检测方法依赖形态及生化特性，因此存在操作复杂繁琐、检测周期长、自动化程度低和无法批量化处理等缺点，难以满足短保质期食品快速放行、现场执法监管、食品安全突发事件应对处理以及举办重大活动时快速检测的需求。近年来，基于免疫和核酸的各种快速检测方法发展起来，免疫方法特异性和灵敏度较差，而基于核酸的方法具有快速、灵敏和准确等优点，主要以实时荧光PCR法为主。然而，实时荧光PCR基于热循环仪，仪器昂贵，且对操作人员要求高，因此在基层实验室推广应用较为困难。

重组酶等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)是新一代核酸分子检测技术，该技术利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温(37-39℃)条件下进行核酸扩增，结合荧光探针实现即时检测，是一种精准、方便、快速的核酸检测技术，实现5-15min完成检测输出结果，比实时荧光PCR技术更快速和便捷。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物和探针。

本发明的第二个目的是提供包括上述引物和探针的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供利用上述试剂盒的RAA检测方法。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的引物和探针，引物的序列为：

上游引物：TTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCG；SEQ ID NO.1；

下游引物：TCAGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCTATAGC；SEQ ID NO.2；

探针的序列为：TAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTT(FAM)-THF-T(BHQ1)-AGGCTACAATTATAG(3'blocker)；SEQ ID NO.3。

进一步地，上游引物为30bp，下游引物为32bp，探针为49bp，探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、淬灭基团和C3-spacer，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，FAM和BHQ1均在T位置修饰，FAM和BHQ1中间间隔1个碱基，被四氢呋喃替换，C3-sapacer位于3’端末尾。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种检测大肠埃希氏菌O157的实时荧光RAA的试剂盒，其包括上述的引物、探针、缓冲液和纯化水。