[发明专利]抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，涉及抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明采用小鼠腹腔培养和体外细胞培养杂交瘤细胞7D12制备单克隆抗体，效价测定检测结果表明，本发明杂交瘤细胞株7D12所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水抗体效价为10⁷，杂交瘤细胞培养上清的效价达到1:1280。本发明制备的单克隆抗体为研究ASFV解旋酶功能及其分子机制积累了关键性的生物学材料，基于该单克隆抗体本身生物学特性建立的间接免疫荧光抗原检测方法为ASFV精准、快速诊断提供了支撑，本发明制备的单克隆抗体能显著抑制或者阻断ASFV复制为ASFV预防和治疗提供了可能的产品支持。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及该杂交瘤细胞株和单克隆抗体的应用。

背景技术

非洲猪瘟(ASF virus)是由非洲猪瘟病毒所致的一种烈性动物传染病，主要感染猪，发病率和死亡率高达100％。其他宿主动物也可携带该病毒(软蜱)。临床上表现为高温、皮肤发绀、结膜出血、腹水，并伴有呼吸障碍和神经症状，发病率、死亡率均达100％；主要的储存宿主为脾脏，发病猪脾脏比正常猪脾脏大很多倍。当病变广泛而严重时，猪群生长受阻，需要进行扑杀，导致严重经济损失。同其他痘病毒一样，ASFV进化而来的免疫逃避机制能帮助病毒在宿主免疫防御条件下生存，形成持续性感染。同时ASFV不同毒株间抗原/免疫靶标多样性促进了病毒能反复感染同一宿主。

ASFV属于非洲猪瘟病毒科，亦是唯一成员，是一种双链线性DNA病毒。电镜下观察负染标本中，病毒粒子大小200nm，外有脂类囊膜，内有双股DNA核心，病毒粒子呈20面体，对应有l892～2172个壳粒(每个壳粒直径为13nm)，中心有1孔，呈六棱镜状，壳粒间的距离为7.4nm～8.1nm。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小170kb～ 190kb。整个基因组含有151个ORF，可以编码150～200种蛋白质，其中包含5个解旋酶，分别被命名为D1133L、B962L、QP509L、Q706L、A589L，均属于解旋酶超家族II家族成员。研究证明ASFV的5个解旋酶当中QP509L和Q706L属于解旋酶超家族IIDEXH/D-box家族中DEAD-box家族成员，并通过基因序列分析间接证明了D1133L为该家族成员。序列分析表明不同ASFV毒株间5个解旋酶的序列相对保守。D1133L基因位于ASFV基因组中心片段上，与BQ96R间隔40kb左右，该基因在病毒DNA开始复制12h后复制，为晚期基因，能够编码产生125.847kDa蛋白。

ASF感染常可通过典型的临床症状和流行情况作出初步诊断。但是ASF常与经典猪瘟临床症状相似而相混淆。在此种情况下，实验室诊断非常必要。因此确诊需要通过电镜负染、血清学方法、病理组织病理学，PCR检测和限制性片段长度多态性分析(RFLP)以及动物接种等方法进行进一步的实验室检验。研究证实了这些方法的可行性，然而，这些检测方法在应用时或多或少会受到一些限制，难以及早检测病原，也不利于大规模的流行病学调查；目前国内外也没有用于血清学检测的免疫检测试剂盒；分子生物学方法特异性高、结果确实，但对实验条件及操作人员的要求较高，因此多用于实验室研究，很难进入临床应用阶段。酶免疫测定技术将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机结合起来，具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备要求不高、成本低、操作简便快捷、无放射性污染、自动化程度高、试剂保存时间长等优点，适用于大批量现地检测工作，将可能成为极具推广价值的诊断方法。随着ASFV对养猪业造成的损失逐年增大，广泛地开展ASFV监测已不可避免，现在还没有适合全世界通用的ASF检测标准。在没有ASFV商品化疫苗的背景下，研制检测非洲猪瘟的 IFA和ELISA诊断试剂盒对该病的疫情监测、流行病学调查及完善免疫策略等都具有重要意义。

发明内容