[发明专利]脊柱侧弯动物模型的建立方法

说明书

本申请实施例提供一种脊柱侧弯动物模型的建立方法，包括以下步骤：基于靶点基因，合成gRNA和Cas9 mRNA，靶点基因与ccdc57基因的外显子对应。将gRNA和Cas9 mRNA载入至斑马鱼的胚胎中，获得F0胚胎；F0胚胎培育至性成熟后与野生型斑马鱼交配获得F1胚胎，筛选有效突变胚胎培育至成年后获得相同基因型的有效敲除斑马鱼，将有效敲除斑马鱼进行自交获得F2胚胎，培育至成年筛选获得ccdc57纯合敲除斑马鱼。由于鱼类脊椎受到的流水阻力与人类直立行走脊椎所受重力相似，因此，斑马鱼建立的脊柱侧弯动物模型更适合对脊椎侧弯致病机理的挖掘和治疗方案的探究。

技术领域

本申请涉及生物医学领域，更具体地说，涉及脊柱侧弯动物模型的建立方法。

背景技术

脊柱侧弯分为先天性脊柱侧弯和特发性脊柱侧弯，先天性脊柱侧弯(congenitalscoliosis,CS)是由椎体发育异常所致，多见于椎体形成障碍和分节不良，前者所致半椎体畸形是导致先天性脊柱侧弯的主要原因。特发性脊柱侧弯(idiopathic scoliosis，IS)是指没有明确的病因导致的脊柱侧弯，是造成人类脊柱弯曲最普遍的原因，影响全世界约3％的儿童，其致病机理尚不明确。因此，治疗方式仅限于通过进行体外辅助支撑或矫正手术治疗脊柱畸形。特发性脊柱侧弯常见于青少年时期并随着年龄增长而加重，在发病进程严重程度上具有性别偏向性，女性患特发性脊柱侧弯时往往发病进程更快，程度也更严重。基因组学关联分析已经鉴定出不同的特发性脊柱侧弯病人群体具有多态性，而表型和遗传的异质性导致难以确定引起病变的具体遗传突变。

脊柱侧弯动物模型的匮乏限制了对特发性脊柱侧弯病理的研究，在人类中导致脊椎侧弯的致病基因，在小鼠敲除模型中往往不呈现脊椎侧弯的表型。小鼠等啮齿类动物以及兔、猴等模式动物是四足动物，它们的脊柱结构和运动生物力学跟人类不同。人类早已适应直立行走，而啮齿类动物被迫直立行走将严重压迫脊柱，导致脊柱畸形。因此亟需寻找一种合适的动物建立脊柱侧弯动物模型。

发明内容

本申请实施例的目的在于提供一种脊柱侧弯动物模型的建立方法，以解决现有技术中的脊柱侧弯动物模型的匮乏的技术问题。

为实现上述目的，本申请采用的技术方案是：提供一种脊柱侧弯动物模型的建立方法，包括以下步骤：

基于靶点基因，合成gRNA和Cas9 mRNA，靶点基因与ccdc57基因的外显子对应，且序列如SEQ ID NO.1所示；

将gRNA和Cas9 mRNA载入至斑马鱼的胚胎中，获得F0胚胎；

F0胚胎培育至性成熟后与野生型斑马鱼交配获得F1胚胎，筛选有效突变胚胎培育至成年后获得相同基因型的有效敲除斑马鱼，将有效敲除斑马鱼进行自交获得F2胚胎，培育至成年筛选获得ccdc57纯合敲除斑马鱼。

优选地，gRNA的合成包括以下步骤：

将T7启动子序列、靶点序列和gRNA scaffold前20个碱基序列融合，得到正向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；将gRNA scaffold后20个碱基序列设计为反向引物，反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示,gRNA scaffold的序列如SEQ ID NO.4所示；

以插入gDNA scaffold的pMD-18T质粒为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物，进行第一次扩增，得到gDNA；

以gDNA为模板合成gRNA。

优选地，第一次扩增的步骤为：94℃下保持2分钟后，进入32个循环，每个循环经历10秒98℃变性，30秒56℃退火，10秒68℃延伸。

优选地，Cas9 mRNA合成包括以下步骤：

以XbaI内切酶线性化pT3.Cas9-UTRglobin质粒，再以线性化的质粒为模板，合成Cas9 mRNA。