[发明专利]一种牙髓间充质干细胞冻存液及冻存方法

说明书

本发明公开了一种牙髓间充质干细胞冻存液，包括组分A和组分B，组分A为无血清培养基，组分B由以下原料组成：钛酸纳米管、5‑磷酸腺苷二钠、维生素E、1,8‑桉叶素、甘油。本发明的冻存液不添加动物血清，避免了动物血清可能引起的外源性污染。组分B中1,8‑桉叶素和甘油协同作用，保护细胞在接近冰点时细胞内的水分不会结晶，避免细胞内的结构损伤。添加的钛酸纳米管、5‑磷酸腺苷二钠、维生素E，一方面使细胞在液氮中冻存过程中保持一定活性，避免细胞的凋亡；另一方面，在结束冻存后有助于细胞快速复苏，恢复活性。本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，采用本发明的冻存液，无需复杂的程序性降温，操作简单。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙髓间充质干细胞冻存液及冻存方法。

背景技术

牙髓间充质干细胞(DPSCs)是一种具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞，具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点，在再生医学领域取得了很大进展，具有广阔的应用前景。同时，DPSCs在适当条件下能被诱导分化为骨组织、软骨组织、脂肪组织、神经组织、肌组织、角膜等多种组织细胞，并能够被诱导为具有类胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞，能够作为以后多种疾病临床转化研究中的种子细胞。目前，已有多个国家建立牙髓干细胞库以供临床治疗或科学研究需要。

在牙髓间充质干细胞的临床应用中涉及到牙髓干细胞的冻存，细胞冻存是将37℃培养的细胞，添加营养成分及防冻保护剂DMSO，通过逐渐降温的方式将细胞长期超低温冻存于液氮中的过程。冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险，需要在降温前加入冻存液作为保护剂。

目前，细胞的冻存除了采用二甲基亚砜(DMSO)对干细胞进行冻存，还会采用普通商品化的培养基或血清进行细胞冻存。目前的这些冻存液在细胞的冻存过程中还是会无法避免地对牙髓干细胞造成一定的损伤，无法保证干细胞的活力，细胞增殖率较低，影响干细胞的临床利用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙髓间充质干细胞冻存液采用无血清培养基，并且不添加DMSO，保证冻存的牙髓间充质干的活性，复苏后的细胞存活率高。

本发明的目的之二在于提供一种牙髓间充质干细胞的冻存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种牙髓间充质干细胞冻存液，包括组分A和组分B，所述组分A为无血清培养基，所述组分B由以下原料组成：钛酸纳米管、5-磷酸腺苷二钠、维生素E、1,8-桉叶素、甘油。

进一步地，所述组分B中的各原料在冻存液中的浓度为：钛酸纳米管6.5-9.2μg/mL、5-磷酸腺苷二钠7.8-8.5μg/mL、维生素E1.5-4.5μg/mL、1,8-桉叶素10.2-14.5mg/mL、甘油25-30mg/mL。

进一步地，所述无血清培养基为DMEM/F12培养基。

进一步地，所述钛酸纳米管的直径为4-10nm，长度为100-500nm，比表面积为200-300m²/g。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存液冻存。

进一步地，上述牙髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：

(1)将待冻存的牙髓间充质干细胞采用组分A的无血清培养基重悬，吹打均匀，降温至4-6℃；

(2)向步骤(1)的混合物中加入组分B，放入-80℃的冷冻环境中，24h后转移至液氮中保存，即完成。

进一步地，步骤(1)中重悬后细胞密度为2-4×10⁶个/mL。