[发明专利]一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒

说明书

本发明属于生物学领域，更具体地，涉及一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒。其通过对携带有E1a基因和E1b基因的HEK细胞瞬时转染包含编码AAV病毒Cap、Rep蛋白的基因质粒以及腺病毒辅助质粒的外源质粒，以该待测rAAV作为种子病毒，在转染外源质粒的HEK细胞中实现rAAV的复制和增殖；通过检测报告基因的表达或检测该细胞中复制和增殖产生的的rAAV基因组拷贝数，计算待测rAAV的感染滴度，不需引入辅助病毒，通过质粒辅助即可高效简单实现rAAV感染滴度的检测，由此解决现有技术rAAV感染滴度检测方法需要引入辅助病毒存在安全风险，且需要配合包装特定细胞系操作复杂等技术问题。

技术领域

本发明属于生物学领域，具体地，涉及一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒。

背景技术

腺病毒伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，是一类小颗粒、复制缺陷、无包膜的单链DNA(ssDNA)病毒，通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的协助，才能进行复制。经人工改造的重组AAV(rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点。近年来，用rAAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点，并已有Glybera和Luxturna两款药物获批上市，但rAAV作为基因治疗载体也存在明显缺点，首先其装载外源基因的容量较小，装载上限约为4.7kb，随着装载外源基因尺寸的增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降；其次天然存在的诸如AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9等多种血清型体内实验虽对不同组织和细胞存在不同的感染偏好性和感染效率，但各种血清型AAV感染体外培养细胞效率整体偏低，研究者们尝试对决定AAV血清型的蛋白衣壳进行改造，获得诸如能够感染多种细胞类型的AAVDJ血清型(Dirk Grimm et al.,2008)等多种血清型，但整体而言，AAV病毒感染体外培养细胞效率仍然较低，从而限制了AAV在细胞水平的各种实验，如分子细胞筛选、感染滴度测定等。

在不加辅助病毒和其他辅助因子的情况下，对于体外培养细胞，AAV病毒感染效率一般较低。目前较常使用的促进AAV体外感染方法是通过腺病毒及单纯疱疹病毒辅助AAV进行感染，这主要是因为AAV病毒的基因组为单链DNA(ssDNA)，进入细胞后必须变成双链DNA(dsDNA)才能转录和翻译外源基因，在没有辅助病毒或其他辅助因子的情况下，AAV单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程很慢，而辅助病毒可以明显促进单链DNA复制成双链DNA，从而可以将外源基因的表达水平提高5-10倍。

研究表明也存在多种辅助因子能够促进AAV感染体外培养的细胞。丁酸盐是一种组蛋白去乙酰酶抑制因子，能诱导染色体的超乙酰化，从而导致沉默基因的诱导表水平。AAV体外感染细胞时也常使用10-50mM丁酸钠作为促感染试剂，使外源基因的表达能够提高5-10倍。zLLL(MG132)、LLnL(MG101)、bortezomib(硼替佐米)等蛋白酶体抑制剂(PI)通过抑制蛋白酶体对进入细胞中AAV的降解，也能够一定程度促进AAV的体外细胞感染(Kristi Jet al.,2004；Anne M D et al.,2001；Paul E M et al.,2010；Jonathan D F et al.,2010)。另外，也有研究报道羟基脲(HU)、聚凝胺(Polybrene)、siRNA敲降核仁素以及使用微球体等方法也能在一定程度促进AAV的体外感染，但促进效果有限(Jarrod S J et al.,2009；Cathryn M et al.,2001)。