[发明专利]一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

本发明通过分子生物学手段从大肠杆菌Escherichia coli MG1655基因组中克隆获得赖氨酸脱羧酶基因cadA、丁二胺转氨酶基因patA以及γ‑氨基丁醛脱氢酶基因patD，从荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens基因组中克隆获得4‑氨基丁酸转氨酶基因gabT和琥珀酸半醛脱氢酶基因gabD。将构建好的重组表达载体pETM6R1‑cadA‑RBS01‑patA‑RBS02‑patD‑gabT‑gabD导入大肠杆菌E.coli W3110后，通过氨苄青霉素抗性平板筛选获得高效生产戊二酸的重组菌株Glu‑02。该重组菌株在5‑L发酵罐下采用补料分批发酵策略，发酵60h，戊二酸产量达到56.2g/L，转化率为62.2％。

技术领域

本发明涉及一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

戊二酸(Glutarate)，俗名胶酸，是一种脂肪族二元羧酸，分子式是C₅H₈O₄，分子量132.11，常温下为无色针状结晶固体，易溶于水、乙醇、乙醚等，在水中溶解度可达430g/L。在所有二元羧酸中，戊二酸的熔点最低，为95-98℃，这一良好的特性使其更适合用于尼龙-4,5和尼龙-5,5等聚酯和聚酰胺的生产。此外，戊二酸也是1,5-戊二醇的前体，1,5-戊二醇是用作助焊剂、活化剂以及重要药物中间体的常用增塑剂。总之，戊二酸作为一种重要的C5平台化合物，在药物和化工合成等领域均具有重要的应用价值和发展潜力。

目前，戊二酸的主要合成方式是化学合成法，其中工业生产主要是在硝酸催化下从氧化环己酮和环己醇的混合物中回收利用，在实验室水平也可完成较少剂量的制备工作，比如可分别以γ-丁内酯、二氢吡喃、戊二腈、环己酮等作为底物，通过一系列化学反应制备而得。然而通过传统化学法合成戊二酸具有成本高、污染严重、操作条件要求高等缺点，因此寻找相对环保的生物法合成戊二酸对环境保护和高效生产以及未来戊二酸的生产前景都具有深远的意义。

近年来，国内外研究人员从生化工程和代谢工程两个方面对微生物生产戊二酸进行了探索研究。到目前为止，文献报道过的戊二酸的生物合成途径有以下四种，分别是：戊烯二酸还原途径、碳链延长与脱羧途径、反己二酸降解途径以及赖氨酸降解途径(包括以戊二胺为中间体的降解途径和以5-氨基戊酸为中间体的降解途径)。其中，赖氨酸降解途径的理论产率最高，达到0.75mol/mol葡萄糖。尤其是以戊二胺为中间体的赖氨酸降解途径由于不需要额外的氧气供应，具有更大的改造和生产潜力。进一步提高戊二酸产量成为亟待解决的问题，同时也是当前世界各国科研人员关注的焦点之一。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一株高产戊二酸的大肠杆菌工程菌，以及应用该工程菌生产戊二酸的方法。本发明通过在大肠杆菌细胞中过量表达合成戊二酸的路径酶赖氨酸脱羧酶、丁二胺转氨酶、γ-氨基丁醛脱氢酶、4-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶，随后通过改变RBS的强度精细化调控关键路径酶丁二胺转氨酶和γ-氨基丁醛脱氢酶的表达水平，进而实现了戊二酸的高效生产，为戊二酸的工业化生产奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主菌中过表达了赖氨酸脱羧酶cadA、丁二胺转氨酶patA、γ-氨基丁醛脱氢酶patD、4-氨基丁酸转氨酶gabT和琥珀酸半醛脱氢酶gabD；所述丁二胺转氨酶通过核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的核糖体结合位点与表达载体相连。

进一步地，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；丁二胺转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；γ-氨基丁醛脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；4-氨基丁酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。

进一步地，所述γ-氨基丁醛脱氢酶是通过核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的核糖体结合位点与表达载体相连。