[发明专利]一种液滴单层平铺式核酸检测芯片及其制备方法

说明书

本发明实施例公开了一种液滴单层平铺式核酸检测芯片及其制备方法，液滴单层平铺式核酸检测芯片，采用液滴平铺式收集保存液滴。液滴收集后，原位扩增以及识别分析，不再转移液滴。另外，可使用矿物油，室温下与PCR过程中不易挥发，降低配套仪器的成本，有效降低使用成本，从根本上解决了氟有机物质挥发性风险问题。

技术领域

本发明涉及核酸检测芯片制作技术领域，具体涉及一种液滴单层平铺式核酸检测芯片及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)提出以来，核酸体外扩增和定量技术已发展成为分子生物学领域的一项核心技术。目前，以PCR为基础的核酸定量检测技术，因其分析速度快、灵敏度高、高通量及诊断时间短的显著优点，成为疾病早期诊断的主要应用技术，并广泛应用于分子测序、基因表达分析、基因突变研究和药物筛选等其他研究领域。

美国ABI公司推出实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环产物量的变化，通过循环阈值(Cycle threshold，Ct)和标准曲线对起始模板进行定量分析，将PCR由定性与半定量的体外合成技术发展成为高灵敏度、高特异性的，可对核酸进行相对定量的基因分析技术。发展至今，qPCR技术已经成为应用最多、灵敏度最高的核酸定量技术，其准确度可达95％。但是，由于qPCR是一种核酸相对定量技术，对低倍差异的分辨能力不足，另外对于含量低于1％的微量突变的检测无能为力。

Vogeldtein和Kinzler提出了一种新的核酸定量技术——数字PCR(D-PCR)技术，该技术的原理是将一个样本稀释成几十到几万份，分配到不同的反应单元，使每个单元至多包含一个拷贝的目标分子(初始DNA模板)，在每个反应单元中进行单个拷贝DNA的PCR扩增，扩增结束后，对有荧光信号的单元进行计数，计数结果即为初始DNA模板的拷贝数。

根据数字PCR的原理，从实现途径上，数字PCR技术包括三个步骤：样品分散、PCR热循环、结果检测分析这三个环节。其中样品分散成大量均一的微单元是关键步骤，是dPCR技术检测敏感性以及绝对定量准确性的关键。根据样品分散方式的不同，现有的数字PCR技术可分为微流控芯片数字PCR技术和液滴数字PCR技术。

目前市面上微液滴式核酸检测系统主要是用于数字PCR(digital PolymeraseChain Reaction)检测，缩写为ddPCR(droplet digital Polymerase Chain Reaction)系统。现有的ddPCR技术包括美国Bio-Rad公司的QX系列微液滴式dPCR系统和法国StillaTechnologies公司的Naica crystal微液滴PCR系统。Bio-Rad公司的系统中检测工作工作过程：首先，通过将配制好的PCR反应试剂分散成数万个液滴，收集在类似离心管的结构中；然后，进行PCR反应；最后，将反应后的液滴导入分析芯片进行结果读出。StillaTechnologies公司的Naica crystal微液滴PCR系统芯片才用的是一体化方案，即“液滴产生-收集-反应”一体化设计。样品分散成的液滴被收集在芯片的液滴收集腔内，呈单层排列，之后液滴不再需要转移，进行PCR反应，最后读出反应结果。

Bio-Rad公司的QX系列微液滴式dPCR系统，采用类似流式细胞分析技术中对百万个液滴逐个进行分析，在工作过程中，液滴需要多次转移，转移过程很难避免污染和破乳的发生。Stilla Technologies公司的Naica crystal微液滴PCR系统芯片采用特殊键合工艺，成本高。

两套系统产生液滴所用的油相为氟化油，为含氟有机混合试剂(例如甲基九氟丁醚等)，易挥发性，需防护措施避免吸入油蒸汽。同时，为保证液滴稳定生成与保存，所用的表面活性剂为特殊合成的，使用成本高。氟化油受热会急剧挥发，为保证PCR过程中液滴的稳定性，通常会保持反应环境高压状态，增加了反应仪器的设计难度与成本。尤其是在转移液滴时，存在氟有机物质挥发性风险问题。