[发明专利]异亮氨酸羟化酶突变体及在(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸合成中的应用

说明书

本发明涉及异亮氨酸羟化酶突变体及在(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸合成中的应用。该异亮氨酸羟化酶突变体是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第38位、56位、88位、123位、135位、138位、155位、162位、176位、179位、182位、196位、205位、226位、228位、234位和236位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。与野生型异亮氨酸羟化酶相比，本发明所述异亮氨酸羟化酶突变体对底物异亮氨酸的活力有大幅度提高，所述异亮氨酸羟化酶突变体可用于高效制备糖尿病治疗药物(2S,3R,4S)‑4‑羟基异亮氨酸，具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种异亮氨酸羟化酶突变体及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，异亮氨酸羟化酶突变体的制备，以及异亮氨酸羟化酶突变体在(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸合成中的应用。

背景技术

1973年，英国Fowden课题组首次从成熟的葫芦巴种子中分离并纯化出其中的主要活性物质，即一种非天然的氨基酸，(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(Phytochemistry 1973,12:1707-1711)。它具有促进胰岛素分泌、降血脂和降低胰岛素抵制的作用(Molecular andCellular Endocrinology 2014,395:51-60)，而且与其它抗糖尿病药相反，(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(HIL)介导的胰岛素反应严格依赖于葡萄糖浓度。这种独特的性质可防止在II型糖尿病治疗中出现不良副作用，使得(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸成为治疗糖尿病最有前途的口服药物之一，具有广阔的市场前景。

早期，(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸主要是从葫芦巴种子中提取获得，提取率仅为0.1％(Phytochemistry 1973,12:1707-1711)。1984年，法国Sauvaire课题组采用70％的乙醇萃取100g脱脂研磨的葫芦巴种子，最终获得0.6g光学纯的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，提取率升高到0.6％(Phytochemistry 1984,23:479-486)。由于资源、技术有限，提取率低，以天然分离提取的方式获得的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸数量非常少，并且葫芦巴的生长周期长，且占用大量的土地资源，所以(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的价格一直很昂贵。随着科学技术的发展以及对(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的需求不断增加，采用化学或生物合成的手段来制备(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸受到人们的广泛关注。

2002年，中国王强课题组以3-羟基-2-甲基丁酸乙酯为起始原料经过一步酶法催化和八步化学反应实现了光学纯(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的合成，得率为39％，非对映异构体过量值(de)为82％(European Journal of Organic Chemistry 2002,2002:834-839)。2006年，法国Claude课题组利用对甲氧基苯胺和乙醛酸乙酯作为底物，经(S)-脯氨酸催化Mannich反应、DBN不对称催化，再经过氧化脱保护、还原，水解和树脂分离纯化制得光学纯的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，总收率约为9.4％，非对映异构体过量值(de)为80％(WO,2006117696,2006)。2010年，中国邓勇课题组对Claude等人的方法进行改进，使选择性和得率进一步提高，经过四步反应条件的优化，总收率提高至30％，非对映异构体过量值(de)提高至86.7％(Chinese Journal of Pharmaceuticals 2010,41:491-494)。2012年，法国Praly课题组以薄荷酮为底物通过加成反应得到E-1,4-氯-2-丁烯后，再经过5步化学反应实现了光学纯(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸的合成，总收率约21％，非对映异构体过量值(de)大于99％(Tetrahedron Letters 2012,53:2817-2821)。虽然化学法能够获得光学纯较高的(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸，但是均存在反应条件苛刻、步骤繁琐、得率低等缺点，因此不适用于大规模工业化生产。