[发明专利]一种植物多倍体的诱导方法

说明书

本发明提供一种植物多倍体的诱导方法，包括以下步骤：外植体花药的采集、愈伤组织诱导、体细胞胚诱导、多倍体诱导、再生植株诱导、倍性鉴定步骤，利用本发明的培养方法，有效的在橡胶树花药离体培养获得体细胞胚的基础上，科学配置培养基，合理调节培养条件，能快速、高效的获得具有优良性状的橡胶树多倍体。

技术领域

本发明涉及植物遗传育种领域，特别涉及一种植物多倍体的诱导方法。

背景技术

橡胶树的次生代谢物质天然橡胶是制作乳胶制品的主要原料，在社会经济发展中具有重要作用。植物多倍体具有细胞巨大、生长速度快、抗逆性强、次生代谢物含量高等特点，人工诱导橡胶树多倍体是提高橡胶树产胶量和抗逆性的一种有潜力的途径。

目前橡胶树人工诱导多倍体的方法主要有两种。一是使用秋水仙碱连续处理植株的生长点(茎尖、芽点)，获得四倍体植株。二是通过化学(秋水仙碱)或物理(高温)手段处理橡胶树发育中的雌雄配子体获得2n花粉或2n卵细胞，然后通过自然授粉或人工授粉与正常卵细胞或者花粉融合，获得三倍体植株。然而，通过秋水仙碱处理生长点的方法得到的大多为嵌合体，而通过理化手段诱导2n配子的发生率极低。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种植物多倍体的诱导方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种植物多倍体的诱导方法：包括以下步骤：

S1、外植体花药的采集：在橡胶树的花序抽出和生长期中，雄花处于黄绿状态时，取雄花用镊子夹碎，使用核酸染料染色，在显微镜观察雄花的发育时期；

S2、愈伤组织诱导：以花粉粒单核居中期到靠边期的花药为外植体，接种于培养基A上培养30～40天，获得愈伤组织，所述培养基A包含以下含量组分：MS培养基、40～60mL/L椰子水、50～90g/蔗糖、1～3.2g/L植物凝胶、0.3～1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～1.8mg/L萘乙酸、0.3～1.5mg/L激动素KT、1～5ug/ml积雪草甙；

S3、体细胞胚诱导：将上述步骤S2中获得的愈伤组织接种于培养基B上，经脉冲光光源照射10～30s后置于培养箱中培养30～50天，获得体细胞胚；

所述培养箱的条件为：培养的24h内，保持氧浓度为3～8％，培养的第2～20天，保持氧浓度为10～20％，培养至第21～50天，保持与室内氧浓度相同；

所述培养基B包含以下含量组分：MS培养基、30～70mL/L椰子水、1～3.2g/L植物凝胶、50～90g/L蔗糖、1.0～3.5g/L活性炭、2～4mg/L激动素KT、0.5～2mg/L细胞分裂素6-BA、0.3～1.3mg/L赤霉素GA3、1～2mg/L脱落酸ABA、0.2～0.5ug/ml泊洛沙姆407；

S4、多倍体诱导：将上述步骤S3获得的体细胞胚在培养基C中浸渍40～60h，获得多倍体诱导后的体细胞胚，所述培养基C包含以下含量组分：2～10mg/mL的秋水仙碱、MS培养基、30～70mL/L椰子水、50～70g/L蔗糖、0.5～1.5g/L植物凝胶、0.3～1.2g/L活性炭、0.1～0.8mg/L激动素KT、0.3～1.5mg/L赤霉素GA3、0.1～0.5mg/L吲哚乙酸IAA；

S5、再生植株诱导：将上述步骤S4获得的诱导后的体细胞胚接种于培养基D上培养30～50天，获得再生植株；

S6、倍性鉴定：取上述步骤S5中获得的再生植株的叶片，采用流式细胞仪进行倍性鉴定。

进一步的，所述步骤S2的培养基A包含以下含量组分：MS培养基、50mL/L椰子水、70g/蔗糖、2.2g/L植物凝胶、1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1mg/L萘乙酸、0.8mg/L激动素KT、3ug/ml积雪草甙。

进一步的，所述步骤S3的脉冲光为100纳米超窄带的脉冲光。