[发明专利]用于产聚合物双歧杆菌蛋白提取的提取剂及提取方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于产聚合物双歧杆菌蛋白提取的提取剂及提取方法与应用。本发明的提取剂包括释放液和无水乙醇，其中，所述释放液为70％甲酸水溶液。本发明还提供了利用该提取剂进行产聚合物双歧杆菌蛋白的提取方法。本发明开发的针对产聚合物双歧杆菌的提取剂及提取方法可有效去除聚合物对提取蛋白的影响，并可依托于MALDI‑TOF技术对双歧杆菌进行快速鉴定。

技术领域

本发明涉及微生物检测与鉴定技术领域。更具体地，涉及一种用于产聚合物双歧杆菌蛋白提取的提取剂及提取方法与应用。

背景技术

双歧杆菌属(Bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状、严格厌氧的细菌属，广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中。双歧杆菌属的细菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一。一些双歧杆菌的菌株可以作为益生菌而用在食品、医药和饲料方面。

通常对于双歧杆菌的鉴定目前主要分为两大类：

一类是形态与生理生化鉴定：X-Gal显色剂可用于初步判定是否为双歧杆菌，而革兰氏染色是最常用的形态鉴定方法。对于在显微镜下形状为Y型、V型或者短杆状、棒状的菌落可进行糖发酵试验、接触酶试验、明胶液化试验、吲哚试验、甲基红试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐试验、糖发酵试验、F6PPK试验、KOH试验、过氧化氢酶试验、需氧试验、运动性检测等生理生化鉴定试验，通过这些试验可以最终确定双歧杆菌的种属及类别。

另一类是分子生物学鉴定：糖发酵等生理生化试验不能区分出性状相近的菌种，而对于菌株水平的鉴定就更加困难，所以科学家们先后利用先进的单胞技术、DNA杂交技术、蛋白质电泳技术、免疫技术以及同工酶谱分析技术等分离出双歧杆菌并探讨了它的种间亲缘关系，且已取得了一批有重要意义的成果。在这些技术的基础上，经过人们的努力，已有了一些更加科学有效的方法，如核酸探针杂交技术、PCR技术、分子标记技术等。

但是从形态学以及生化反应方面对双歧杆菌进行鉴定，通常耗时长，鉴定过程繁琐冗长，而通过分子生物学方面对双歧杆菌进行鉴定正在成为主流手段。近年来MALDI-TOF技术日渐成熟，对于细菌的鉴定越来越简单便捷，通常一个细菌分纯后只需要几分钟就可以得到鉴定结果，且结果可靠。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。

但是在使用MALDI-TOF对双歧杆菌进行鉴定的过程中发现，某些双歧杆菌在生长过程中会产生聚合物，例如胞外多糖，在基质与此类双歧杆菌进行共结晶时会使得聚合物与蛋白同时被电离，采集结果中的聚合物峰对蛋白峰产生影响，在对比数据库时会出现鉴定错误的情况，因此去除聚合物保留蛋白就成为鉴定此类双歧杆菌的关键。

目前，尚未有专门针对产聚合物双歧杆菌的适用于质谱鉴定的前处理试剂或方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于产聚合物双歧杆菌蛋白提取的提取剂。

本发明的另一个目的在于提供一种产聚合物双歧杆菌蛋白的提取方法。

本发明的第三个目的在于提供上述提取剂和提取方法的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于产聚合物双歧杆菌蛋白提取的提取剂，该提取剂包括释放液和无水乙醇，其中，所述释放液为70％甲酸水溶液。在本发明中，％如无特别说明表示体积百分浓度。

本发明提供的提取剂能够针对某些产聚合物双歧杆菌，例如，长双歧杆菌长亚种CGMCC1.5052，长双歧杆菌长亚种CGMCC1.5082，长双歧杆菌长亚种CGMCC1.5014等，有效去除聚合物，提取出蛋白，然后通过MALDI-TOF质谱技术采集蛋白谱图，可实现在食品检验，医疗检验等方面对该类双歧杆菌快速鉴定得到种属信息。