[发明专利]一种消除背景差异的萝卜与甘蓝同源基因功能研究方法

权利要求书

1.一种消除背景差异的萝卜与甘蓝同源基因功能研究方法，其特征在于，该方法通过在萝卜与甘蓝远缘杂种中进行转基因或基因编辑，超表达或突变萝卜和甘蓝的同源基因，比较分析转基因植株和突变体的表型，研究萝卜和甘蓝同源基因的功能及其功能分化。

2.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述萝卜与甘蓝远缘杂种是利用萝卜与甘蓝远缘杂交，杂种植株加倍成异源四倍体，多代自交后使遗传稳定和育性恢复。

3.根据权利要求2所述的研究方法，其特征在于，所述萝卜包括RR基因组的所有亚种、变种，所述甘蓝包括CC基因组的所有亚种、变种，所述异源四倍体是指含有RRCC基因组的植株。

4.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述萝卜与甘蓝远缘杂种的遗传转化是农杆菌介导的遗传转化。

5.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述遗传转化步骤为：

无菌苗制备：选取饱满的种子，清洗、消毒后均匀播种于播种培养基上，所述播种培养基组成为：1/2MS，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌；

预培养：选取苗龄6-10d的幼苗，当外植体用下胚轴时，切取下胚轴，在预培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上；当外植体用子叶盘时，切下子叶后平放于预培养培养基上，封口膜将培养皿封好，预培养2-4d；所述预培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加AgNO₃至5mg/L；

摇菌：配置LB培养基，其中加入筛选抗生素和利福平，从平板上挑取含有目的基因超表达或敲除或编辑的载体的农杆菌或直接加入新鲜菌液，震荡培养过夜，震荡条件：28℃，250r/min；

农杆菌悬浮液配置：摇菌至OD600＝0.6-0.8，菌液倒入无菌离心管中，离心，弃上清后加入DM悬浮液，重悬后倒入无菌三角瓶，放入摇床中30min-1h，震荡条件250r/min，28℃，之后，取出菌液，以加入乙酰丁香酮的DM悬浮液为背景，稀释菌液至OD600＝0.5-0.6；所述DM悬浮液的制备方法为：MS+蔗糖30g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮至100μmol/L；

共培养：将预培养2-4d的外植体置于OD600＝0.5-0.6的农杆菌悬浮液中侵染，期间不断摇晃，之后将外植体置于无菌滤纸上，将菌液吸干，在共培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上，子叶盘不需滤纸直接放于培养基上，将培养皿封好后，共培养2-4d，所述共培养培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+2,4-D 1mg/L+KT 0.3mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入乙酰丁香酮至100μmol/L；

延迟培养:将共培养2-4d的外植体转移到延迟培养培养基上，培养2-4d，所述延迟培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L,调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO₃至5mg/L，加Tinmentin至200mg/L；

筛选培养：将延迟培养2-4d的外植体转移到筛选培养培养基上，光照强度为2000-4000lx,培养2-3周后开始出现芽分化，每培养20-30d转到新的筛选培养基中，所述筛选培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO₃、Timentin和潮霉素，分别至5mg/L、200mg/L和10mg/L；

生根培养：将发育完全的芽切下，转移至生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+NAA 0.1mg/L,调节pH为5.8，高压蒸汽灭菌后加入AgNO₃、Timentin和潮霉素，分别至5mg/L、200mg/L和5mg/L；

炼苗：将组培生根的转基因苗取出，流水冲掉根部的培养基后移栽到蛭石中，置于培养箱中培养，光周期为20h光照+4h黑暗，每天浇水保证湿度，3d后开始浇营养液，炼苗7d后移植到温室中。