[发明专利]用于细胞保存的保护剂

说明书

本发明提出了用于细胞保存的保护剂，所述保护剂包括：DMSO、小分子醇和酰胺。本发明的保护剂不仅可以在低温保存下避免细胞损伤，复苏后的细胞具有较高的活率及较强的扩增能力；而且还可以在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，有助于维持细胞活率；细胞毒性低，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及用于细胞保存的保护剂。

背景技术

免疫治疗(Immunotherapy)主要是利用自身免疫系统的强化或是外加赋予免疫能力来预防及治疗疾病的方式。免疫治疗是利用免疫系统达成对疾病高专一性、高效率以及持久性的治疗系统。人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是免疫治疗的重要原料，PBMB可以在体外被诱导分化为多种免疫细胞，例如细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)以及自然杀伤性T淋巴细胞(NKT)。这些免疫细胞在抗感染、抗肿瘤方面有重要作用。免疫细胞化学的抗肿瘤能力会随着人年龄的增长而减弱，因此将免疫细胞分离并在体外低温保存是保留种子细胞的有效方法。PBMC的低温保存也成为免疫治疗的重要环节。

目前，细胞的保存主要是通过缓慢降温的方式将细胞置于-156℃的气相液氮或-196℃的液氮中，以暂停细胞的代谢活动，将细胞的特性保存起来。在降温过程中细胞内外介质会形成冰晶，将对细胞造成致命损伤。为避免损伤的发生，降温前需将细胞悬浮于低温保护剂中。目前最常用的低温保护剂是10％二甲基亚砜(DMSO)并配合80％-90％的胎牛血清(FBS)或人血清(HAS)。

DMSO是一种小分子量有机物，极易溶于水或其它有机溶剂，容易穿透细胞膜。DMSO溶于水后可使水的冰点降低15-20℃，并抑制冰晶生长。因此DMSO可减少细胞在降温过程中受到损伤。但DMSO亦具有一定的生物毒性，高浓度的DMSO或细胞在DMSO中悬浮时间过长会导致蛋白质等生物大分子变性。更严重的是，国内外已有病例报道指出细胞回输液中残留的DMSO会引起患者头晕、呕吐、腹泻、胃痉挛等副作用。因此，寻找DMSO的替代物，以降低DMSO的使用浓度成为细胞低温保存保护剂的优化方向之一。

FBS或HAS中的蛋白可与细胞膜结合，使细胞免受冰晶损伤，同时维持细胞渗透压为细胞提供保护。但是使用FBS或HAS也会有加大的风险。FBS中通常会携带动物源性病毒。例如，欧洲、澳洲、美洲都曾发生过疯牛病，上述产地来源的FBS则很可能会受到污染，携带有疯牛病病毒。若使用FBS作为冻存保护剂，也会将细胞污染，进而在回输时将病毒传播给患者。

此外，PBMC冻存也存在一些通病，例如保存期限较短、细胞复苏后活率不高、扩增能力受损等。

因此，目前用于细胞保存的保护剂仍有待解决。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了用于细胞保存的保护剂，所述保护剂不仅可以在低温保存下避免细胞损伤，复苏后的细胞具有较高的活率及较强的扩增能力；而且还可以在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，有助于维持细胞活率；细胞毒性低，具有广泛的应用前景。

本发明提出了一种用于细胞保存的保护剂。根据本发明的实施例，所述保护剂包括：DMSO、小分子醇和酰胺。

针对传统PBMC低温保存保护剂中的DMSO，发明人发现采用小分子醇和酰胺替代部分DMSO，不仅可以避免PBMC在低温保存条件下造成细胞损伤，而且降低了DMSO浓度，以降低细胞毒性，保证使用安全。针对传统PBMC低温保存保护剂中的FBS或HAS，发明人发现采用小分子醇和酰胺替代FBS或HAS，还可以避免细胞污染、降低病毒感染的风险。另外，采用上述配方的保护液还可以在常温下维持细胞的生命活动，防止生物大分子受到氧化反应的破坏，有助于维持细胞活率；细胞毒性低，具有广泛的应用前景。