[发明专利]一种连续切向流干细胞分离纯化方法

说明书

本发明提供了一种连续切向流干细胞分离纯化方法，该方法主要包括以下步骤：S1：将间充质干细胞放入反应器中，加入微载体和无血清完全培养基培养7天，用生理盐水清洗，再加入胰酶消化30min，回填无血清完全培养基终止消化，制得预处理液；S2：将预处理液放置于料液瓶内，将所述料液瓶连入TFF系统，在所述TFF系统的出液口管路末端连接透过液收集瓶，回流液管路连接到料液瓶，当透过液收集瓶收集一定体积的废液时，向料液瓶中加入等量洗液，洗液加入完毕，清空透过液收集瓶，待料液瓶中料液剩余预计体积时，停止系统运行，即得间充质干细胞；本发明提供的连续切向流干细胞分离纯化方法得到的细胞回收率在80％以上，细胞活率可达到85％以上。

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，特别涉及一种连续切向流干细胞分离纯化方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，间充质干细胞)是一种具有自我复制更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨等多种组织细胞。它的功能包括免疫抑制、促进机体组织器官的修复、促进血管新生/再生、支持造血干细胞的增殖和分化等，其临床适应症比较广。脐带来源的间充质干细胞取材方便，无道德伦理争议，并且细胞数量多，增殖快，易于传代扩增培养。为了满足临床需求，间充质干细胞需要在体外进行大规模扩增培养。而培养后细胞的收集也是获得治疗用干细胞的重要部分。传统的离心方法进行收集细胞，需要人为操作和大型离心设备，过程繁琐，耗时长，且存在污染风险。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种连续切向流干细胞分离纯化方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种连续切向流干细胞分离纯化方法，该方法主要包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞放入反应器中，加入微载体和无血清完全培养基培养，用生理盐水清洗，再加入胰酶消化，回填无血清完全培养基终止消化，制得预处理液；

S2：将预处理液放置于料液瓶内，将所述料液瓶连入TFF系统，在所述TFF系统的出液口管路末端连接透过液收集瓶，回流液管路连接到料液瓶，当透过液收集瓶收集一定体积的废液时，向料液瓶中加入等量洗液，洗液加入完毕，清空透过液收集瓶，待料液瓶中料液剩余预计体积时，停止系统运行，即得间充质干细胞；

其中，加入微载体和无血清完全培养基培养时间优选为7天，加入胰酶消化时间优选为30min，但其他的培养时间或消化时间也在本发明保护范围内，当透过液收集瓶内收集了1/4-1/2预处理液的体积的废液时，即可加入等量洗液，所述预计体积为清空透过液收集瓶中废液的体积的1/5-1/15。

其中，使用本发明的方法对间充质干细胞进行分离纯化，细胞的回收率可达到80％，细胞活率可达到85％。收集浓缩后的间充质干细胞，添加新鲜培养基继续培养，第2天观察细胞生长状态。细胞贴壁良好，形态呈细长纤维状。浓缩洗滤过程对细胞的活性及生长增殖能力没有影响，微载体呈蜂巢状，直径为0.5-10mm，所述微囊的孔径为10nm-10000nm，微载体的制备方法包括以下步骤：

该微载体的制备方法包括以下步骤：

(1)制球：将5L浓度为1％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5％的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，纳米化海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为1:3；

(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次，洗涤方法是加入纯化水后以50rpm的转速搅拌5min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为1:1；

(3)明胶包被：将10L浓度为0.05％的明胶溶液和10mL浓度为0.3％的戊二醛溶液混合均匀制得混合液，将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中在温度为20℃、搅拌速度为50rpm的条件下反应30min，混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为1:1；