[发明专利]一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG‑ODN及其应用，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：以筛选出来的11个CpG‑ODN片段随机组成10组免疫激活单元，且每组免疫激活单元中各个CpG‑ODN片段位置信息不相同，将10组免疫激活单元通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段构建重组质粒FVX‑CpG，制备含有重组质粒FVX‑CpG的制剂，该制剂生产成本低，克服了在体内CpG‑ODN的不稳定性、序列多样性和个体差异等缺陷；不仅能诱导猪体内天然免疫功能激活，还能激活猪体内对PRRSV的获得性免疫功能，提高猪体内对PRRSV的免疫反应诱发作用，降低PRRSV发病率，降低猪养殖成本。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)的致病因子，是引起母猪繁殖障碍及新生仔猪呼吸道症状和高死亡率的新RNA病毒传染病病毒。PRRSV最早于1987年在美国发现，1991年荷兰人Wensvoot首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒，随后德国、美国、英国等也分离到了该病毒。目前，该病毒已遍及北美洲、欧洲，在全球范围内传播，且各地相继发生流行性感染，给养猪行业造成严重的经济损失。虽然，猪繁殖与呼吸综合征灭火病毒疫苗已经得到了广泛使用，但伴随有副作用，且仅有部分免疫保护作用，使得对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护效果不理想。

CpG基序(CpG motifs)是指一类以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心序列构成的特定结构。大量研究表面，CpG基序是一种强有力的非特异性免疫刺激DNA序列，能够直接或间接激活 T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞。将含有CpG基序的DNA称为CpG-DNA，将人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)称为CpG-ODN。经合成CpG-ODN进行试验研究，发现细菌DNA的免疫刺激作用，仅与其中具有特异性侧翼的非甲基化CpG核苷酸有关；与细菌DNA不同，哺乳动物本身的DNA 分子不具有免疫刺激作用。哺乳动物和其他脊椎动物DNA分子中CpG 基序出现的频率很低，且60-90％的CG基序中胞嘧啶第五碳原子发生甲基化。

在1995年，Arthur M.Krieg等人通过分析人工合成的不同序列 CpG-ODN的免疫刺激活性，得出：CpG-ODN需有一定的长度，在一个CpG-ODN中可以有一个或多个CpG基序，CpG基序两侧特异的嘌呤和嘧啶以及CpG基序之间相隔碱基的不同，都会影响CpG基序的免疫刺激类型和强度。因此，有研究者就猪先天性及获得性免疫的有效提升，提供了一种CpG-ODN以及含有该CpG-ODN的重组质粒、制剂，例如专利申请号为201910229571.5的对猪具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其作用中的报道。尚未见有对PRRSV具有免疫刺激作用免疫刺激单元的研究报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种对 PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

本发明创造的目的之一在于提供对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，克服了传统 CpG-ODN在体内不稳定性、序列多样性以及个体差异性等特征，对 PRRSV具有特异性免疫刺激作用，能够诱导猪体内对猪繁殖与呼吸综合征的免疫免疫反应作用，降低猪繁殖与呼吸综合征发生率，降低养猪行业经济损失。

本发明创造的目的之二在于提供含有上述CpG-ODN的重组质粒，该重组质粒为FVX-CpG，其中所述FVX为载体，核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，制备成本低，经XbaI和EcoRI两个酶切位点插入CpG-ODN，以基因合成手段构建而成。