[发明专利]一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用

说明书

本发明提供一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据根据肺炎克雷伯菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；不依赖于PCR等贵重仪器，甚至能在37℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间，可以实现单管现场、快速检测，具有特异性强、灵敏度高以及检测速度快的优势。

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，尤其是涉及一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上，存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，以上叶较为多见。肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，大小0.5～0.8×1～2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛。有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，在普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。肺炎克雷伯菌感染引起的病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。细菌具有荚膜，在肺泡内生长繁殖时，引起组织坏死、液化、形成单个或多发性脓肿。病变累及胸膜、心包时，可引起渗出性或脓性积液。病灶纤维组织增生活跃，易于机化；纤维素性胸腔积液可早期出现粘连。在院内感染的败血症中，克雷伯杆菌以及绿脓杆菌和沙雷氏菌等均为重要病原菌，病死率较高。肺炎克雷伯菌作为公共卫生监测的一项重要内容，在传染病防控以及口岸卫生检疫有重要的意义。

目前，肺炎克雷伯菌检测方法的包括传统的检测方法、免疫学检测以及分子生物学检测方法等。传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在症状时期检测到细菌的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于肺炎克雷伯菌的检测。目前，国内外已建立的肺炎克雷伯菌检测方法有实时PCR检测方法、半巢式PCR检测方法、LAMP检测方法等，但PCR方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而LAMP方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用LAMP方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。RAA技术不依赖于PCR仪器的便捷性能，且检测时间较PCR方法或荧光PCR显著缩短，而灵敏度与荧光PCR相当甚至高于，是革命性的技术突破，能充分扩大核酸扩增技术的应用领域。在RAA反应过程中，肺炎克雷伯菌DNA通过利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟。此外，RAA技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套RAA多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式PCR技术无法相比的。目前，国内外还没有公开用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其试剂盒的相关内容。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高以及检测速度快的用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于肺炎克雷伯菌荧光RAA检测的引物和探针序列，根据肺炎克雷伯菌的特异保守区域为靶标区域设计特异性引物及荧光RAA探针，引物序列具体如下：

正向引物为5'-TGGCCGGTTGCGTACAGGTTGATCGTTATGA-3'；

反向引物：5'-AGGGAAGCGGTCACGTTGTAGATCTCACTGTCAC-3'；寡核苷酸探针：