[发明专利]一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明公开了一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19174。将哒螨灵的完全抗原免疫BALB/c小鼠。将高效价，低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞通过培养基培养，再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对哒螨灵具有较好的检测灵敏度（IC₅₀值为9.09 ng/mL），可用于食品中哒螨灵的残留检测。

技术领域

本发明涉及一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。

背景技术

哒螨灵的英文通用名为：Pyridaben，中文名又称：牵牛星、速螨酮、哒螨酮，化学名称：2-叔丁基-5-(4-叔丁苄基硫)代-4-氯-3(二氢)哒嗪酮；作用机理：哒螨灵属于哒嗪酮类杀虫、杀螨，它触杀性极强，但是没有熏蒸、内吸和传导作用。它主要是抑制肌肉组织、神经组织和电子传递系统染色体I中谷氨酸脱氢酶的合成，从而发挥杀虫作用。主要用途：对所有食植性害螨都具有明显的防治效果，比如全爪螨、叶螨、合瘿螨、小爪螨等，而且在螨的不同生长期都有效，例如在螨的卵期、若螨期、成螨期，在成螨的移动期也有防治效果。在我国主要用于柑桔、苹果、梨、山楂等水果作物上，在蔬菜(茄子除外)、烟草、茶叶、棉花、及观赏植物上也可使用。

目前，哒螨灵检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，还需要一种快速，简单的分析哒螨灵残留物的方法。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测哒螨灵的前提是得到对哒螨灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对哒螨灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明人尝试通过杂交瘤细胞制备哒螨灵单克隆抗体，但在制备能分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备哒螨灵半抗原和哒螨灵完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出哒螨灵单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的哒螨灵单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。此杂交瘤细胞株分泌的哒螨灵单克隆抗体对哒螨灵具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为9.09ng/mL），可以用于建立哒螨灵的免疫学检测方法，检测食品中哒螨灵的残留。

本发明的技术方案，一株分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19174。

本发明提供了上述一种分泌哒螨灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

（1）制备哒螨灵半抗原及哒螨灵完全抗原，将获得的哒螨灵完全抗原制备成含抗原的弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；

（2）将得到的哒螨灵完全抗原弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；