[发明专利]一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用；本发明基于TALEN技术，利用胞嘧啶脱氨酶结合UGI，通过不同的条件实验，找到了可以对靶位点进行碱基编辑的体系，命名为TALEN‑BE。通过在报告系统和內源基因的数据表明，TALEN‑BE系统可以实现胞嘧啶转换为胸腺嘧啶。该编辑系统的出现极大的拓展了碱基编辑的应用范围，同时TALEN技术所涉及的序列长度相对较小，可以包装进入AAV载体，从而对遗传疾病的基因治疗提供巨大的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种不受基因序列限制的碱基编辑系统及其制备方法和应用。

背景技术

分子生物学技术的发展，特别是基因编辑技术的出现，包括锌指核酸酶技术(zincfinger nucleases,ZFNs)、转录激活剂样效应核酸酶技术(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)和聚集规则间隔短回文重复序列系统(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)，使得基因操作的效率得到了显著提高。一般意义上，这三种技术涉及精确靶向DNA序列以引入双链DNA断裂(double-strand breaks,DSB)，进而利用细胞的修复机制尝试修复双链断裂，通常通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或者同源重组的方法修复(homology-directed repair,HDR)。而这两种修复都可能导致碱基对的插入或缺失，进而引起移码突变。在临床上，利用这两种方法的效率和安全性均有待于提高。

在CRISPR/Cas9基础上发展出来的碱基编辑技术因为不引起DNA双链断裂，原位修复致病突变等高效安全的特点迅速成为了基因治疗的热点。胞嘧啶碱基编辑器是将dCas9或Cas9切口酶与大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1融合，它通过脱氨基作用将胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，之后通过DNA复制或修复，尿嘧啶(U)被转化成胸腺嘧啶(T)。其能够在目标基因中精确而有效地引入点突变，不需要双链DNA断裂或任何供体模板，展现出很大的基因编辑潜力。胞嘧啶碱基编辑器不需切割DNA造成DSB，形成的indel低于1％，实现的基因编辑更精确；而且，这种方式将脱靶效率降低到低于自然背景的10倍，实现的基因编辑更安全。目前碱基编辑系统已经广泛应用于多个领域，并显示出了不可估量的价值。

但基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术有几个明显的缺陷。一是CRISPR/Cas9系统依赖于PAM序列而发挥功能，这使得有些位点无法靶向。虽然目前开发了可以靶向多种PAM的系统，但总体看来，可以进行精确修复的致病突变只有25％左右。二是目前的碱基编辑系统存在着序列较大的缺点，超出了常用于基因治疗的AAV载体的容量，虽然目前开发了分开形式的编辑系统，但其效率受到大大的影响。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种不受基因序列限制的碱基编辑系统。

本发明的第二个目的是提供上述碱基编辑系统的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述碱基编辑系统的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种不受基因序列限制的碱基编辑系统TALEN-BE，是在TALEN基因编辑系统上进行优化得到的，其包括只能切割单链形式的TALEN系统、胞嘧啶脱氨酶和UGI，所述只能切割单链形式的TALEN系统由TALEN系统内使用的两个FOKI任意失活一个得到；其中胞嘧啶脱氨酶连接到失活形式一侧的TALEN表达载体的N端，UGI连接到未失活一侧的TALEN表达载体的N端。