[发明专利]基于金结合多肽标签功能化肉毒素的微生物诊断传感器

说明书

病原微生物的及时检测对疾病的管控和治疗非常关键，本工作拟研发了一种基于金结合多肽标签功能化肉毒素的微生物诊断传感器。传感器通过将不等长PCR的扩增产物与肉毒素功能化的纳米金核酸探针进行组装构成肉毒素功能化的复合物，联合SNAPtide探针将检测信号转变成荧光信号或者可见光信号来实现对病原微生物的超灵敏检测。本工作的创新性体现在：传感器通过普通PCR扩增结合肉毒素功能化的纳米金核酸探针实现，设计简单、方便，并且可以直接通过荧光和可见光双重信号对病原微生物进行检测，为基于纳米金的比色检测传感器的设计提供一种新的策略。

技术领域

本发明为满足人们越来越希望能够通过简单、灵敏的检测方法获得精确检测结果的需求，提供一种基于金结合多肽标签功能化肉毒素的微生物诊断传感器。

背景技术

医学流行性和食源性病原微生物，包括原生生物、病毒和细菌等，其种类繁多且变异迅速，近年来已构成了严重的公共卫生安全隐患，给人类健康和财产安全造成了巨大威胁和损失。针对病原微生物的快速检测技术，不仅是其有效防控的前提，也是科学用药的基础。

病原微生物的检测方法有很多种，传统的检测方法包括病原体培养和血清检测、核酸检测等，但是这些方法往往存在检测时间比较长、对于一些新发现的病原微生物比如新冠病毒无法使用、需要昂贵的仪器耗材等缺点。近年来，越来越多的基于传感器的病原微生物检测方法应运而生。其中信号报告物是传感器的一个重要组成部分。当前信号标记物主要可以分为三类：基于酶的信号标记物、基于荧光功能分子的信号标记物和基于纳米材料的信号标记物。基于酶的信号标记物虽然能够很大程度上缩短检测时间，但是存在背景信号强的弱点；基于荧光功能分子的信号标记物虽然为病原微生物的原位检测提供可能，但是却存在着不稳定的现象；基于纳米材料的信号标记物具有体积小、能在细胞内实时测量、对细胞无损伤或微损伤等诸多特点，但是往往操作比较复杂而且需要实验人员具有相关实验经验。因此，寻找一种具有低信噪比的灵敏的信号报告物成为构建病原微生物检测传感器的关键。

2019年COVID-19的大爆发表明，1.单一的一种检测方法已经很难满足检测的需求，实际运用时往往需要多种检测方法联用；2.使用少量的试剂和仪器即可满足需求的检测方法需要被建立；3.依赖交叉学科的检测运用是一种大趋势。综上所述，病原检测的方式相对较多，各类方式均存在优缺点，为弥补相应检测方式的缺陷，除需要采用多种方式联合应用的同时还需要进一步的提高灵敏度与特异度。

肉毒素是由肉毒杆菌在繁殖过程中所产生的一种神经毒素蛋白，是毒性最强的天然物质之一，也是世界上最毒的蛋白质之一。根据抗原性的不同，肉毒素可以分为A-H共8类。其中，A型肉毒素是毒性最强并且最常见的一种类型，它通过切割人类SNAP-25蛋白抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱囊泡释放，阻断神经肌肉接头处的冲动传导，引起肌肉麻痹而致病。SNAPtide（FITC/DABCYL）猝灭探针对是A型肉毒素作用底物SNAP-25蛋白的等效替代物，能够在被BoNT/A切割之后产生荧光信号（λex: 490 nm; λem: 523 nm）。因此，我们联想到使用毒性最强的A型肉毒素做为信号报告物，将检测信号进行转换为荧光信号，从而提高传感器的检测灵敏度。

综上，本工作拟研发了一种基于金结合多肽标签功能化肉毒素的微生物诊断传感器——botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) activated complexassay (BACA)。通过不等长PCR的扩增产物与肉毒素功能化的纳米金核酸探针的组装产物进一步切割SNAPtide猝灭荧光对从而将检测信号转变成荧光信号来实现。同时，发明中含有spacer修饰的正向引物和biotin修饰的反向引物进行PCR扩增保证了纳米金复合体产物可以被链霉亲和素磁珠分离，从而可以直接通过荧光和可见光双重信号对病原微生物进行检测，并且具有很高的灵敏度。

发明内容

本发明旨在改善目前微生物诊断领域中缺乏高灵敏度和精确性检测方法的现状，提供一种超灵敏的基于功能化肉毒素的检测策略。