[发明专利]基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法

说明书

本发明涉及一种基于split‑HRV 3C蛋白酶‑E.coli ClpXP系统的蛋白相互作用检测方法，原理为：由于ClpXP‑SsrA降解途径的存在，融合sfGFP‑HRV 3C蛋白酶底物多肽‑SsrA的融合蛋白可被大肠杆菌ClpXP复合物识别，导致sfGFP的降解，呈现低强度绿色荧光。将捕获蛋白和诱饵蛋白分别融合在的split‑HRV 3C蛋白酶的N端和C端结构域，当捕获蛋白和诱饵蛋白发生相互作用时，N端和C端HRV 3C蛋白酶融合形成具有完整功能的HRV 3C蛋白酶，对相应底物多肽切割识别，导致sfGFP的积累和荧光强度的提升。本发明通过对ClpXP‑SsrA降解机器，sfGFP和split‑HRV 3C蛋白酶的整合，根据绿色荧光强弱，可在宽阔温度范围内，高效灵敏的检测蛋白‑蛋白相互作用。

技术领域

本发明涉及蛋白相互作用研究领域，具体涉及一种基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法。

背景技术

研究蛋白质相互作用对于理解生物体内新陈代谢过程以及所涉及到的蛋白质功能有着至关重要的生物学意义。现如今，已经发展了许多用于研究蛋白质相互作用的方法，比如：细菌/酵母双杂交技术,免疫共沉淀技术(Co-IP)，GST pull down技术，split-蛋白互补技术等等。酵母双杂交技术的特点在于敏感、高效、操作简易可大规模的进行验证，在实际应用当中，由于酵母双杂交的敏感性而伴随着一定的假阳性，同时由于反应发生在细胞核内，所以也并非适用于所有的蛋白质。同时Co-IP使用免疫标签会有假阳性互作，GSTpull down需要体外表达纯化蛋白，也有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题提供一种基于大肠杆菌ClpXP降解机器(SPEC)的利用split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用检测方法，包括以下步骤：

步骤1、将超折叠绿色荧光蛋白sfGFP融合在HRV 3C蛋白酶底物序列LEVLFQ↓GP的N端,将SsrA降解标签融合在HRV 3C蛋白酶底物序列的C端，得到HRV 3C蛋白酶底物多肽sfGFP-LEVLFQGP-SsrA；

步骤2、将sfGFP-LEVLFQGP-SsrA整合到大肠杆菌的染色体上，得到大肠杆菌重组菌株；

步骤3、将HRV 3C蛋白酶拆分为N端HRV 3C蛋白酶结构域和C端HRV 3C蛋白酶结构域，将捕获蛋白融合到N端HRV 3C蛋白酶结构域，得到第一重组蛋白；将诱饵蛋白融合到C端HRV 3C蛋白酶结构域，得到第二重组蛋白；

步骤4、将第一重组蛋白和第二重组蛋白转入大肠杆菌重组菌株中共表达，利用流式细胞仪检测重组大肠杆菌细胞的绿色荧光信号，若检测到有绿色荧光信号，则说明捕获蛋白和诱饵蛋白之间存在相互作用，若检测到没有绿色荧光信号，则说明捕获蛋白和诱饵蛋白之间不存在相互作用。

进一步的，所述步骤2中HRV 3C蛋白酶的切割位点为K82位点。

进一步的，所述SsrA降解标签可被大肠杆菌内源性ClpXP降解复合物所识别，从而导致SsrA的N端融合的蛋白降解。

进一步的，所述HRV 3C蛋白酶底物N端融合有sfGFP,C端融合有SsrA降解标签；所述HRV 3C蛋白酶底物多肽为sfGFP-LEVLFQGP-SsrA。

进一步的，所述捕获蛋白和诱饵蛋白为待研究相互作用的目的蛋白对；所述捕获蛋白融合在N端HRV 3C蛋白酶结构域，诱饵蛋白融合在C端HRV 3C蛋白酶结构域。

进一步的，所述捕获蛋白和诱饵蛋白发生相互作用时，N端和C端HRV 3C蛋白酶融合形成具有完整功能的HRV 3C蛋白酶，对相应底物多肽切割识别，导致sfGFP信号的积累和细胞荧光强度的提升。