[发明专利]一段分离的核苷酸序列在无矿化肌间骨斑马鱼构建中的应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，涉及了一段分离的核苷酸序列在无肌间骨斑马鱼构建中的应用，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。以SEQ ID NO.1为靶基因进行基因突变，挑选有突变的F0的胚胎培养成亲本鱼，通过F0突变体亲本与野生鱼杂交产生F1胚胎，筛选出有义的突变杂合子F1培养至成鱼，然后F1杂合子自交能产生纯合子，杂合子，野生型的三种基因类型的F2后代。利用基因突变的方法获得无矿化肌间骨斑马鱼品系，为后续研究鱼类肌间骨的分子形成机制和培育无肌间骨经济鱼类提供基础，具有科学研究的基础价值和应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一段分离的核苷酸序列在无矿化肌间骨斑马鱼构建中的应用，通过对该核苷酸序列进行突变，可获得无矿化肌间骨的斑马鱼。

背景技术

斑马鱼(Danio rerio)是一种热带观赏鱼，属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cypri nidae)鱼丹属(Danio)。因其体侧具有像斑马样纵向暗蓝色与银色相间的条纹而得名。斑马鱼具有体型小，易饲养发育快速，性成熟周期短，繁殖力强，雌雄易分辨，胚胎体外发育，易于观察和操作等优点，是一种用于研究脊椎动物胚胎学和发育遗传学的经典模式动物(Br ooks et al.,2014)。斑马鱼的基因组及转录组数据已较完善。斑马鱼产卵量大，成活率高，体外受精，胚胎在母体外发育并且透明。受精卵的直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。

鱼类肌间骨(intermuscular bone)是由肌膈结缔组织连续同源骨化而来的膜骨，根据其附着位置不同，分为髓弓小骨、脉弓小骨和椎体小骨三种类型。肌间骨的存在与鱼类的分类地位有极大的关系,其仅存在低等真骨鱼类中,系统演化过程表现为数目由少到多，多到少，再到无的过程。我国的大宗淡水鱼类都含有一定数量的肌间骨，如青鱼(Mylopharyngodonpi ceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(H.nobilis)、团头鲂(Megalobramaamblycephala)等鲤科鱼类，对鲜鱼的食用和鱼糜制品的加工带来极大不便，这对我国鲤科鱼类养殖业的发展和产值产生了直接的影响。研究表明斑马鱼肌间骨的骨化顺序与类型与鲤科鱼类相似(Nie et al.,2018)；巴西无肌间骨的大盖巨脂鲤(Colossoma macropomum)个体的发现证明肌间骨对鱼类本身的生命活动无显著影响(Perazza et al.,2017)；研究表明由雌核发育筛选获得的无肌间骨的草鱼的生长发育正常(徐晓峰等，2015)。因此，在一定程度上，去除或减少肌间骨的数量是可行的。已有研究也对肌间骨发生发育及数目相关的分子遗传信息进行了发掘(Wan etal.,2016；Nieet al.,2017；Wan et al.,2017；Wan et al.,2019)，提供了肌间骨研究的遗传数据基础，但之前未筛选出与肌间骨数目直接相关的基因信息。

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(C as9)是2013年初出现的新一代基因编辑技术。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统人工改造而成，具有制作简单、使用方便、成本低、作用效率高等特点(MussolinoCathomen,2013)。CRISPR/Cas9技术自发现至今，已被证实能在不同物种广泛使用，包括哺乳动物、微生物和植物，如人(Homo sapiens)(Liang et al.,2015)、小鼠(Musmusculus)(Coppola et al.,2015)、果蝇(Drosophila melanogaster)(PortBullock,2016)、斑马鱼(Xie etal.,2016)等。CRISP R/Cas9基因编辑技术为筛选鱼类肌间骨发生发育关键调控基因以及培育无肌间骨的鱼类新品系提供了高效的途径。

发明内容