[发明专利]一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法

说明书

本发明涉及一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法。首先，设计和构建基于DNA发卡结构物的单分子反应器。DNA发卡结构物的茎干部分包含与蛋白互作的基序，把手部分通过聚合酶链式反应进行地高辛和生物素标记。其次，制备与DNA互作的蛋白。再次，将DNA发卡结构物固定在磁珠和玻璃片之间，在微流控反应池内通过单分子力学方法进行DNA解链实验。最后，系统测试小分子药物浓度对结合了蛋白的DNA的解链反应的影响，绘制药物剂量‑响应曲线，计算半数抑制浓度，评估小分子药物对蛋白核酸互作的药效。本发明属于生物大分子互作和单分子药理学领域，为分子生物学研究、药物开发和药理评估开发了一种直接测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的新方法。

技术领域

本发明属于生物大分子互作和单分子药理学领域，尤其是涉及一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法。

背景技术

氨基酸基序在蛋白的结构和功能中发挥重要的作用，并且普遍是药物靶点。譬如，骨髓清除药物白消安(Busulfan)能够将氧化还原酶蛋白CXXC基序中的半胱氨酸转化成为脱氢丙氨酸和羊毛硫氨酸。再如，蛋白激酶PKCθ通过CXXC基序与CD28相互作用，成为小分子药物二甲基富马酸酯(dimethyl fumarate，DMF)的作用靶点。因为越来越多的DMF靶点得以鉴别，譬如，NF-kappaB和GAPDH，DMF能够治疗的疾患也有望能从银屑病和多发性硬化症扩展到肿瘤。事实上，对蛋白靶点中的基序进行选择性的修饰是目前药物研发中流行的方法和策略。

药物靶点的鉴别和对剂量-响应关系进行量化评估在药物研发中至关重要，而且依赖于有效的生物物理方法。特别值得指出的是，检测方法给出的信号应该稳健而且能够避免人工伪迹。例如，白藜芦醇曾被报道是sirtuin的激动剂，但是后期发现这是一个多肽底物上的荧光标记引起的实验伪迹。也就是说，白藜芦醇的sirtuin激动活性完全依赖于酶底物上共价修饰的荧光基团。

单分子力学技术，作为一种无标记方法，已经在多种药物干预的蛋白核酸互作研究中证明是一种行之有效的量化分析手段。越来越多的研究显示基于磁镊、光镊和纳米孔的技术是研究蛋白核酸互作等药物靶点的极佳平台。例如，单分子磁镊曾经揭示了抗癌药物拓扑替康(Topotecan)阻碍拓扑异构酶I解旋的分子机制。但是，目前依然缺乏稳健通用的单分子检测器来探索药物干预下的蛋白核酸互作机制。

基于单分子磁镊和DNA发卡结构物，本方法发明了一种单分子检测器来研究药物干预下的蛋白核酸互作。这种单分子方法通过对DNA发卡结构物进行解链，测量解链时间。因为蛋白结合能使得蛋白核酸复合物更加稳定，所以蛋白结合时的解链时间就比没有蛋白时更长。如果一种药物能够抑制蛋白核酸复合体的形成，那么药物干预下的蛋白核酸复合体形成就变少，总体稳定性变低，从而导致DNA解链时间变短。因为MLL1蛋白CXXC结构域结合CpG，所以本方法就以MLL1 CXXC为例来使用这一单分子检测器研究蛋白结合DNA的反应。本方法设计了一个CpG DNA发卡结构物，富含AT的背景序列中等距排布了5个CpG位点。CpG位点之间间距20bp，使得蛋白核酸结合位点信号能够做到基线分离。本方法发现外力导致的MLL1 CXXC-CpG复合体解离时间大约需要10毫秒。作为初步的概念验证实验，本方法展示如何通过测量解链时间来发现DMF作用于MLL1 CXXC-DNA复合体的剂量-响应关系。本方法发现，DMF作用于MLL1 CXXC-DNA复合体的半数抑制浓度IC50大约是1μM。这也是DMF靶向CXXC家族蛋白的第一例研究。本方法显示基于磁镊的无标记单分子反应器适用于研究靶向蛋白核酸互作的药物效用。本方法的单分子反应器有望成为药物发现领域的通用方法。而且，至目前为止，基于单分子力学测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的方法未见报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法。