[发明专利]一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用

说明书

本发明公开了一种人成熟的胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)突变体及其融合蛋白，本发明还公开了一种重组核酸分子，其包含可操作连接的表达调控序列、编码上述IGFⅡ突变体的核酸序列和编码功能性酸性α‑葡糖苷酶的核酸序列。本发明还公开了一种重组腺相关病毒，其包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含上述重组核酸分子。本发明还公开了所述重组腺相关病毒载体用于更有效地治疗庞贝氏症的用途。

技术领域

本发明涉及生物治疗领域，尤其涉及一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用。

背景技术

庞贝氏症(Pompe disease)是一种由于溶酶体缺乏酸性α-葡糖苷酶(GAA)而导致的溶酶体糖原贮积症，GAA缺乏造成糖原无法分解，因此也被称为Ⅱ型糖原贮积症。所有患者病程相同，随着糖原在不同组织中的逐渐堆积，最终导致组织衰竭甚至死亡。庞贝氏分为早发型和迟发型。早发型明显的临床症状包括巨舌、肝脏肿大、心脏肥大、肌张力减弱，一般会在一岁之前死于心脏及呼吸系统衰竭；迟发型主要临床症状包括由下肢开始的慢性四肢肌肉退化、呼吸功能不全、神经系统影响、除Wolff-Parkinson-White综合征(左心室肥大，主动脉上行支扩张)不伴随明显心脏疾病；其它非典型症状包括脊柱僵直、脊椎侧弯、体重下降。庞贝氏症发病率约为1/30000到1/50000，严重影响身体健康，还给社会和家庭造成沉重的负担。

目前已上市的蛋白药物是Genzyme公司研发的lumizyme，给药剂量为20mg/kg，给药方式为静脉给药，两周一次。这是一种酶替代疗法(ERT)疗法，是将重组人溶酶体酶(例如酸性α-葡糖苷酶)给予患者以补充其缺乏的生物活性以改善临床症状。此类蛋白药物的主要缺点是在体内半衰期短、有效利用率低、给药频率高、易造成患者依从性差，长时间治疗给患者家庭造成经济负担。

溶酶体贮积症治疗的前提是溶酶体酶必须在溶酶体内发挥作用，因而需要一种由细胞外进入细胞，随后递送至溶酶体的机制。为提高药物的利用率，使其有效递送至溶酶体，也做了大量的研究工作。研究发现，在哺乳动物中，对大多数可溶性溶酶体酶而言，其蛋白骨架上的分支碳水化合物结构被修饰形成甘露糖-6-磷酸(M6P)的特殊碳水化合物结构。M6P是天然生物信号，其通过膜结合M6P受体将溶酶体酶转移到溶酶体中。这种方法虽然已显示出一定的安全性，但其在减轻临床症状的效果方面存在差异，主要是由于不同溶酶体酶M6P含量不同所致，其中某些重组溶酶体酶的M6P含量较低，细胞摄取减少，因而降低药物疗效。因此需要更高剂量才能达到治疗效果，但这样不仅增加成本，还延长输注时间，导致显著的免疫应答，造成过敏反应。

为改善药物的疗效，实现溶酶体酶的靶向性运输至溶酶体中的一种潜在策略是引入靶向肽以有效地将治疗性溶酶体酶运输到溶酶体而不需要传统M6P碳水化合物结构。研究发现，非阳离子依赖型M6P受体(CI-MPR)存在于大多数细胞类型的表面上，且同时具有胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFⅡ)的结合结构域，因此该受体也称为IGFⅡ/CI-MPR受体。CI-MPR受体对于IGFⅡ的亲和力明显高于其对于M6P的亲和力，因此可使用IGFⅡ作为靶向肽把重组溶酶体酶运输到溶酶体中。虽然IGFⅡ还可以和胰岛素受体、IGFⅠ受体、IGF结合蛋白结合，但亲和力较低，并且通过对IGFⅡ的截断和突变，可以维持IGFⅡ与CI-MPR的高亲和力，并显著降低其与其它受体的亲和力，例如：27位的Leu取代Tyr，43位的Leu取代Val的IGFⅡ突变体可显著减少或消除IGFⅡ与IGFⅠ受体结合(Torres等人，J.Mol.Biol(1995).248(2):385-401)。26位的Ser取代Phe能够降低IGFⅡ对IGFBP-1和IGFBP-6的亲和力(Bach等人，J.Biol.Chem(1993).268(13):9246-9254)。因此IGFⅡ肽可能被用作替代传统M6P碳水化合物结构的靶向基序以促使重组溶酶体酶被细胞摄取并转运到溶酶体中。

腺相关病毒(AAV)具有多种血清型，普遍存在于人类和灵长类动物体内。rAAV作为基因治疗载体，具有非常多的优势，如感染效率高、感染范围广、长期表达的高安全性等。目前已被广泛应用于临床实验。