[发明专利]一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

本申请属于试剂盒领域，具体为一种基于LFD‑RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、测流层析检测试剂、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。本发明的RMA结合侧流层析技术检测新型冠状病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的新型冠状病毒的快速筛查检测。

技术领域

本申请属于试剂盒领域，具体为一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其的检测方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎，是指由于新型冠状病毒感染所导致的肺炎。新型冠状病毒是一种RNA病毒，这种病毒传染性极强，人群普遍易感，且潜伏期比较长。

为了阻止新型冠状病毒传播范围的不断扩大，使新冠肺炎疫情得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。目前对新型冠状病毒核酸检测的方法主要为实时荧光定量PCR法，但是常规的PCR检测需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程、较长的检出时间以及专业的技术人员进行操作。

重组酶介导扩增技术(RMA)是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。与PCR相比，RMA具有反应温度恒定、操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA技术可以与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合进行扩增产物的检测。在RMA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被核酸外切酶III识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RMA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。

本发明采用LFD-RMA技术建立快速检测新型冠状病毒的方法，为新冠病毒的现场检测提供一种快速、简单、可靠的新方法。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒及其的检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于LFD-RMA技术检测新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，

上游引物序列ORF1ab-F为：

5’-TACATTGGCGACCCTGCTCAATTACCTGCACCAC-3’；

下游引物序列ORF1ab-R为：

5’-[Biotin]AATTTCAGCAGGACAACGCCGACAAGTTCCGAGG-3’；

探针序列ORF1ab-P为：

5’-[FAM]CATTGCTAACTAAGGGCACACTAGAACCAGAAT[dSpacer]ATTTCAATTCAGTGT[C3-spacer]-3’。

优选的，所述试剂盒还包括：阳性标准品、阴性标准品、酶混合物、侧流层析检测试纸条、醋酸镁、缓冲液和产物稀释液。

优选的，所述阳性标准品为新型冠状病毒的ORF1ab基因片段与pMD18-T载体相连接后得到的重组质粒；所述阴性标准品为无菌双蒸水。

优选的，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。

优选的，所述试剂盒的RMA扩增反应试剂的配比如下：