[发明专利]一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用

说明书

本发明涉及一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用，属于细胞培养技术领域。本发明所述方法包括：用生理盐水清洗乙醇水溶液喷淋后的脐带，洗去血液，得到干净脐带；将干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，分离得到华氏胶；将华氏胶剪碎成组织块，等体积比与Tryple‑Express消化酶混合，消化，得到消化后的组织块；用完全培养基离心清洗消化后的组织块，弃上清，进行贴壁培养和消化培养，得到从组织块中生长爬出的原代分离的人脐带来源的间充质干细胞。本发明提供的方法能够增加原代脐带间充质干细胞获得的数量，还能够减少对原代细胞的损伤，为间充质干细胞的规模化培养提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种临床用人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用。

背景技术

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。不表达或低表达免疫排斥相关标记，且取材方便，无伦理争议，是目前较为理想的再生医学干细胞治疗的种子细胞之一。目前获得脐带间充质干细胞的方法主要有酶消化法和组织块贴壁法两种传统方法，但这两种方法所获得的原代脐带间充质干细胞数量与理论上人脐带所含的间充质干细胞的数量相差很多，同时酶消化法还会对原代脐带间充质干细胞造成损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用。本发明提供的方法能够增加原代脐带间充质干细胞获得的数量，还能够减少对原代细胞的损伤，为间充质干细胞的规模化培养提供了技术支持。

本发明提供了一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法，包括以下步骤：

1)用生理盐水清洗乙醇水溶液喷淋后的脐带，洗去血液，得到干净脐带；

2)将步骤1)得到的干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，分离得到华氏胶；

3)将步骤2)得到的华氏胶剪碎成组织块，等体积比与Tryple-Express消化酶混合，37℃消化15～25min，得到消化后的组织块；

4)用第一完全培养基离心清洗消化后的组织块，弃上清，将弃上清的组织块进行10～15d的贴壁培养和消化培养，得到从组织块中生长爬出的原代分离的人脐带来源的间充质干细胞。

优选的是，步骤1)所述脐带在喷淋乙醇水溶液前，还包括：用生理盐水浸没后震荡清洗。

优选的是，步骤1)所述乙醇水溶液中，乙醇的体积百分含量为70～80％。

优选的是，步骤3)所述组织块的体积为1～2mm³。

优选的是，步骤4)所述离心的条件为2500rpm离心5～10min。

优选的是，步骤4)所述第一完全培养基为体积百分含量为8～10％的完全培养基：α-MEM无血清培养基加入体积百分含量为8～10％的HeliosμLtraGROAdvanced。

优选的是，步骤4)所述贴壁培养和消化培养的方法包括以下步骤：

将弃上清的组织块培养4～6h后，加入第一完全培养基进行培养，每4～6d更换新的完全培养基，待细胞融合度达75～85％，去除组织块，加入生理盐水洗去残余完全培养基，弃去生理盐水，加入Tryple-Express消化酶，25～37℃消化1～3min，至细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起，得到消化好的细胞；将消化好的细胞与生理盐水混合，离心，弃上清，将沉淀用第二完全培养基重悬；所述第二完全培养基为体积百分含量为4～5％的完全培养基。

优选的是，所述离心的条件为1500rpm离心5～6min。

本发明还提供了Tryple-Express消化酶在原代分离人脐带来源的间充质干细胞中的应用。