[发明专利]一种血液肿瘤突变负荷参考品及其制备方法

说明书

本发明提供了一种血液肿瘤突变负荷(bTMB)参考品及其应用，涉及ctDNA形式的高TMB值和低TMB值参考品，对DNA使用酶切或超声两种方法进行片段化。该参考品能够很好地模拟真实的血浆ctDNA检测样本形式，为bTMB的准确定值提供了参考。

技术领域

本发明涉及肿瘤基因突变检测领域，具体涉及一种血液肿瘤突变负荷(bTMB)参考品及其制备方法。

背景技术

肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)是一种可定量的生物标志物，用来反映肿瘤细胞中所含有的突变数目，通常用肿瘤细胞基因组编码区的每百万碱基的突变数来衡量，简单来说就是肿瘤细胞携带的突变数量。非同义突变越多，肿瘤细胞产生的异常蛋白越多。肿瘤突变负荷越高，产生的新抗原也越多，有更大的可能性激活免疫系统对肿瘤的识别。

在多癌种中证实，TMB高的患者总体生存率也更高。研究表明，用来预测癌症治疗效果的TMB值，在不同的癌种中其实是不一样的，这也就意味着，可能不存在一个适用于所有癌种的TMB固定值。对不同种类的癌症和不同的用药方案分类分析结果显示，不同癌种TMB值差异较大。TMB是目前除PD-L1表达之外研究最为深入的免疫治疗疗效预测性生物标志物之一。因为肿瘤组织样本在取材、肿瘤异质性和动态监测等方面具有很大的局限性，不容易直接计算得出肿瘤组织的TMB值。而血液样本具有无创多次重复取样、克服肿瘤异质性、可实现动态监测和可提供肿瘤全景信息等优势，研究者们一直在探索基于血液样本计算的TMB值，即血液肿瘤突变负荷(bTMB)，从而提升TMB检测在肿瘤免疫治疗中的实用性。

随着bTMB更多的被临床认可和大规模应用，基于Panel检测的bTMB算法标准也有待建立，各临床研究中对于bTMB计算标准存在较大差异。因此，为验证及规范行业bTMB的检测及计算流程，有必要推出一种能够用于bTMB检测各个环节的参考品，尤其是具有配对样品的参考品，这对于bTMB的准确定值及临床应用极为重要，而目前市面上还没有相应的血液肿瘤突变负荷参考品。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种血液肿瘤突变负荷(bTMB)参考品及其应用，涉及循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)形式的高TMB值和低TMB值参考品，对DNA使用酶切或超声两种方法进行片段化，能很好地模拟真实的血浆ctDNA检测样本形式，为bTMB的准确定值提供了参考。

本发明提供一种血液肿瘤突变负荷参考品的制备方法，包括如下步骤：

(1)筛选配对细胞系：

所述配对细胞系包括肿瘤细胞系和其配对的细胞系；

(2)酶切法或超声打断法获得所述配对细胞系的ctDNA；

(3)配对细胞系的ctDNA提取、浓度测定；

(4)配对细胞系的ctDNA混合和质检，获得血液肿瘤突变负荷参考品；

(5)参考品的肿瘤突变负荷值检测和肿瘤突变负荷值计算。

进一步的，所述步骤(2)中所述酶切法使用的酶是微球菌核酸酶。

进一步的，所述步骤(4)中所述混合的比例为所述肿瘤细胞系的ctDNA所占的体积比为0.1％～10％，所述配对的细胞系的ctDNA所占的体积比为99.9％～90％。

进一步的，所述步骤(4)中所述质检采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认。

进一步的，所述步骤(5)包括如下步骤：

(1)对所述参考品进行全外显子组测序；

(2)突变过滤：使用过滤参数对检测出的变异进行过滤；