[发明专利]一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，包括PCR八连管、干粉状检测试剂，其中所述PCR八连管中各试剂管内均设干粉状检测试剂，且所述干粉状检测试剂与PCR八连管各试剂管上端面间间距不大于PCR八连管各试剂管高度的1/4，且不小于2毫米。其检测方法包括检测预制，试剂盒运行及结果判定等三个步骤。本发明一方面试剂盒结构简单且制备快捷方便，制备及使用成本低廉，且有效克服了传统检测作业中检测试剂对人体造成的危害；另一方面在进行肺炎克雷伯氏菌检测作业中，有效的缩短了检测步骤、简化了检测操作内容，从而极大的提高了检测效率和检测精度，并有助于降低检测成本。

技术领域

本发明涉及一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法，属微生物检测技术领域。

背景技术

鉴定肺炎克雷伯氏菌常用方法是利用PCR方法，通用引物扩增细菌16S rDNA，得到目标片段后进行凝胶核酸回收纯化。将纯化后得到的核酸送往测序公司进行基因测序，将得到的基因序列与NCBI上的序列进行比对得出克雷伯氏菌的类型。具体的检测步骤包括①提取乳房炎奶样中DNA；②使用PCR方法进行DNA扩增；③核酸凝胶电泳，观察目标条带；④凝胶核酸回收；⑤基因测序；⑥NCBI BLAST 比对，确定克雷伯氏菌类型等六个步骤，虽然传统的检测方法可以初步满足检测作业的需要，但一方面传统的检测方法不能针对性的检测出肺炎克雷伯氏菌，且步骤繁琐、耗时较长，检测作业精度相对较差；另一方面传统的检测方法在检测中，需要进行跑胶、收胶、测序等步骤操作，且检测中需要使用到TAE原料及切胶等作业，从而导致传统的检测方法的操作步骤复杂且检测成本较高，同时TAE原料及切胶作业对检测人员的健康也构成了较大的危害。

因此针对这一现状，需要开发一种全新的奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及相应的检测方法，以满足实际使用的需要。

发明内容

本发明的目的是提供本发明提供一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒及检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒，包括PCR八连管、干粉状检测试剂，其中所述PCR八连管中各试剂管内均设干粉状检测试剂，且所述干粉状检测试剂与PCR八连管各试剂管上端面间间距不大于PCR八连管各试剂管高度的1/4，且不小于2毫米。

进一步的，所述的干粉状检测试剂包括探针、上下游引物、DNTP、Taq聚合酶，具体由以下重量份数物质构成：Tris-HCl（pH=8.3）3%—10%、KCl 3%—8%、MgCl 0.5%—3%、DNTP1%—4.5%、上游引物 1%—10%、下游引物 1%—10%、探针1%—8%、DMSO 1%—10%、UDG酶0.1%—0.5%、Taq酶0.2%—5%，余量为甘油。

进一步的，所述探针、上下游引物基因序列为：

探针序列为：FAM-CACACTGGAACTGAGACACGGT-BHQ1；

上游引物序列为：CTGGTCTGAGAGGATGAC；

下游引物序列为：CCGCTGAAAGTGCTTTAC。

进一步的，所述PCR八连管为25 μL体系。

一种奶牛乳房炎肺炎克雷伯氏菌检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

S1，检测预制，首先对PCR八连管进行离心作业，使PCR八连管管壁上的干粉状检测试剂落入到PCR八连管底部，然后向PCR八连管的各试剂管中分别添加3—8 μL的将待检测核酸，然后分别向各试剂管中添加去离子，时各试剂管混合液体积达到25 μL，并对试剂管通过密封盖进行密封处理；