[发明专利]一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，属于基因工程疫苗技术领域。本发明公开的一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，首先以GCRV‑I、II S10基因为靶基因，构建融合表达GCRV‑I、II衣壳蛋白的真核表达载体，并进行体外表达鉴定；第二阶段制备大肠杆菌DH5α菌蜕，将裂解质粒pHH43导入大肠杆菌DH5α，制备出具有完好外膜的大肠杆菌菌蜕；第三阶段进行大肠杆菌菌蜕装载重组质粒研制二价核酸菌蜕疫苗，并进行实验室免疫效果评价研究，初步确定了免疫方案并进行了免疫示范应用。

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗技术领域，更具体的说是涉及一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法。

背景技术

草鱼出血病一直是我国草鱼养殖中最难控制的疾病，目前对于病毒病还没有特效的治疗方法，一直采用疫苗免疫作为控制该病的主要方法，最早全国各地相继应用组织浆灭活疫苗进行免疫防治，取得了一定的成效，但组织浆灭活疫苗需大量鱼体扩增病毒，费时费力，并存在扩散病毒的危险。后又研制成功细胞灭活疫苗及细胞培养弱毒疫苗并取得了疫苗生产批准文号，在多个地区进行了推广应用，对草鱼出血病的控制起了很大的作用，但细胞灭活疫苗的制备需大量培养病毒并传代扩增，成本很高，也存在灭活不完全会散毒的危险。弱毒活疫苗常能有效的刺激机体的免疫系统产生体液免疫和细胞免疫，其主要缺点是接种机体后毒力可能出现返强，以及运输保存时要求的条件较高。鉴于这些常规疫苗难以解决的问题以及GCRV出现新的毒力较强的变异毒株即GCRV-II在全国范围内流行的情况，迫切需要研制一种安全、高效且多价的疫苗用于预防草鱼出血病的爆发。

核酸疫苗(nucleic acid vaccine)以其无致病性、研制简单等诸多优点成为现代疫苗的研究热点，该疫苗也称基因疫苗(genetic vaccine)或DNA疫苗(DNA vaccine)，是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基因克隆到真核表达质粒载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。该疫苗具有安全、价廉、易于制备、改造等优点，故一经问世便迅速发展起来，本实验室也研制了GCRV-I VP7的核酸疫苗，取得了一定的草鱼免疫效果。但越来越多的研究也发现核酸疫苗存在着免疫方式有限、免疫原性不强，常需高剂量多次免疫等问题。因而，人们开始转向对核酸疫苗佐剂和载体的研究，希望能够通过各种佐剂、载体的使用来扬长补短，使其免疫效果得到进一步提高。

菌蜕的问世，为核酸的输送带来了新的希望，菌蜕是利用基因灭活的方法而产生的细菌空壳，即噬菌体PhiX174裂解蛋白E介导的G-菌的裂解而产生，由于G-菌具有完整的生物亲和性的外膜结构，如菌毛能够进行特异的细胞和组织定位，其表面的脂多糖成分可以作为一种天然佐剂，而且菌蜕的胞周间隙和细胞空腔可接收大量外源物质，因而菌蜕成为一种新型无病原性的生物载体和靶向工具，并且有望在增强核酸疫苗免疫原性、弥补其接种方式受限方面开辟一个新的途径，为更高效的DNA疫苗的开发提供一个具有广阔前景的技术平台。

因此，提供一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1)构建GCRV-I-II-S10重组质粒；

(2)制备大肠杆菌DH5α菌蜕；

(3)制备GCRV二价核酸菌蜕疫苗：

将步骤(2)制备的大肠杆菌DH5α菌蜕重悬于含GCRV-I-II-S10重组质粒的PBS体系中，加入CaCl₂溶液，摇床孵育，离心，收集沉淀，得到GCRV二价核酸菌蜕疫苗。